Apesar de evidências sorológicas da circulação do vírus do oeste do Nilo (WNV) na Argentina, Colômbia e Venezuela, este vírus ainda não foi detectado na maioria dos países da América do Sul. Em 2009 e 2010 foi realizada uma investigação para a circulação de WNV em artrópodes, equídeos, ovinos e crocodilianos do Pantanal de Mato Grosso do Sul, Brasil. Um total de 4514 artrópodes e 90 amostras de soro de crocodiliano foi submetido ao isolamento viral e RT-PCR para detecção de flavivírus. Paralelamente, amostras de soro de 892 equídeos, 238 ovinos, 90 crocodilianos foram inicialmente submetidas ao ensaio de imunoabsorção por ligação enzimática de bloqueio de epitopos específico para flavivírus (ELISA de bloqueio). As amostras soropositivas foram sequencialmente submetidas ao teste de neutralização por redução de placas (PRNT90) para WNV e outros onze flavivírus que circulam no Brasil para confirmar a detecção de anticorpos neutralizantes específicos. O vírus Ilhéus foi isolado de espécimes de Ochlerotatus scapularis e potenciais novos flavivírus foram detectados em grupos de Culex chidesteri e Mansonia pseudotitillans. Todas as amostras de crocodilianos foram negativas no isolamento viral e RT-PCR Todos os crocodilianos e ovinos foram negativos para a presença de anticorpos específicos para flavivírus por ELISA de bloqueio. Entre as 466 (52,2%) amostras de soro de equídeo soropositivas no ELISA de bloqueio, 94 (10,5%) foram soropositivas para o vírus Ilhéus, 57 (6,4%) para o vírus da encefalite de Saint Louis, 27 (3%) para o WNV, cinco (0,6%) para o vírus Cacipacoré e uma (0,1%) para o vírus Rocio usando PRNT90, com um critério de positividade a diferença de quatro vezes entre os títulos de anticorpos para todos os flavivírus testados. Não foram detectadas evidências sorológicas da circulação dos quatro vírus dengue, vírus da febre amarela, vírus Bussuquara ou vírus Iguape em equídeos na região. O presente estudo é o primeiro relato de evidência sorológica por PRNT90 da circulação de WNV no BrasilDespite evidence of West Nile virus (WNV) activity in Colombia, Venezuela and Argentina, this virus has not been reported in most South American countries. In 2009 and 2010, an investigation for WNV in arthropods, horses, sheep and caimans from the Pantanal, state of Mato Grosso do Sul, Brazil was conducted. A total of 4514 arthropods and 90 caiman serum samples were submitted to viral isolation and RT-PCR for flavivirus detection. Concurrently, the sera of 892 horses, 238 sheep and 90 caimans were initially tested using a flavivirus-specific epitope-blocking enzyme-linked immunosorbent assay (blocking ELISA) for the detection of flavivirus-reactive antibodies. The seropositive samples were further tested using a plaque-reduction neutralization test (PRNT90) for WNV and other 11 flaviviruses that circulate in Brazil to confirm the detection of specific virus-neutralizing antibodies. Ilheus virus was isolated from Ochlerotatus scapularis pool and potentially novel flaviviruses were detected in Culex chidesteri and Mansonia pseudotitillans pools. No flavivirus genome was detected or arbovirus isolated from caiman blood. All caimans and sheep were negative for flaviviruses-specific antibodies using the blocking ELISA Among 466 (52.2%) blocking ELISA-seropositive horse serum samples, 94 (10.5%) were seropositive for Ilheus virus, 57 (6.4%) were seropositive for St. Louis encephalitis virus, 27 (3%) were seropositive for WNV, five (0.6%) were seropositive for Cacipacore virus and one (0.1%) was seropositive for Rocio virus using PRNT90, with a criteria of \2265four-fold antibody titer difference. There was no serological evidence of Dengue viruses, Yellow fever virus, Bussuquara virus and Iguape virus infection in local horses. The present study is the first report of serological evidence using PRNT90 of WNV activity in Brazil