Dissertation
Geração in vitro de células dendríticas humanas e sua relação com a vacina BCG Moreau
Registro en:
PEDRO, T. Q. C. Geração in vitro de células dendríticas humanas e sua relação com a vacina BCG Moreau. 2016. 110 f. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Vigilância Sanitária) – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2016.
Autor
Pedro, Thaize Quiroga Chometon
Resumen
A Tuberculose é considerada uma das principais causas de morte em todo o mundo. A BCG corresponde a única vacina aprovada, apresentando boa relação custo-eficácia para prevenção das formas disseminadas da TB em crianças. Contudo, a proteção fornecida pela mesma é considerada limitada na prevenção de TB pulmonar em adultos. Com relação ao controle de qualidade da produção da BCG, existe uma carência de ensaios laboratoriais. Hoje o ensaio de UFC é utilizado como método de quantificação para as vacinas vivas e como um substituto dos ensaios de potência. Este trabalho propõe um ensaio in vitro utilizando células dendriticas, considerando a primeira linha da resposta imunológica, para avaliação da potência da vacina. Com esse propósito, utilizou-se moDCs diferenciadas in vitro de monócitos isolados de PBMCs. Para o isolamento de monócitos e a diferenciação de moDCs foram testadas difentes técnicas e meios de cultivo, respectivamente. Por fim, a técnica de isolamento por microesferas magnéticas de seleção negativa e positiva e o cultivo e difernciação das células em placa com RPMI e SH e a concentração de 500 UI/ml de cada GMCSF e IL-4. As moDCs imaturas foram infectadas como 3 lotes distintos de BCG (lote A- 6,86 x 106 UFC/ml, lote B- 2,48 x 106 UFC/ml e lote C- 9,82 x 106 UFC/ml) em quatro diluições (1:10, 1:20, 1:40 e 1:60) por 24 horas, Como controle utilizou-se DCs não estimuladas (controle negativo), DCs estimuladas com LPS (controle positivo) e BCG contendo bacilos não viáveis (BGG irradiada e irradiada + aquecida). Após as 24 horas foram avaliados os marcadores de superfície CD14, CD1a, CD209, TLR2 e 4, CD80, CD86, CD40, CD83, HLA-DR e CCR7 por citometria de fluxo. E a partir do sobrenadante das culturas foram dosadas as citocinas pró-inflamatórias IL-12, IL-18, TNF-α, IL-1α e a citocina anti-inflamatória IL-10 por ELISA e feito a contagem de UFC para observação dos bacilos não internalizados pelas moDCs. Como resultado, observou-se uma diminuição na expressão de CD14, um aumento de CD209 enquanto a expressão de CD1a não sofreu alterações quando os monócitos eram diferenciados em moDCs. Já como relação os marcadores CD80, CD86 e HLA-DR, esses apresentaram um aumento de expressão nas células infectadas por BCG na comparação com DCs imaturas, enquanto CD40 apresentou resultados semelhante ou uma diminuição da expressão quando as moDCs foram infectadas por BCG . Não foi observada uma proporcionalidade entre o numero de UFC e a expressão da maioria desses marcadores. Com relação as citocinas, apenas TNF-α apresentou um aumento em seu nível quando as moDCs foram infectadas com BCG, sendo esse aumento proporcional ao numero de UFC e a diluição utilizada. Por fim, com relação a contagem de UFC, mostrou uma menor contagem de bacilos no sobrenadante de moDCs provenientes de seleção positiva. E nesse mesmo grupo, não houve proporcionalidade entes o numero de UFC inicial da BCG e o presente no sobrenadante enquanto nas moDCs provenientes de seleção negativa essa proporção se manteve. Como conclusão a BCG foi capaz de induzir maturação das moDCs in vitro. TNF-α e CD80, mostraram-se como candidatos mais promissores para um futuro ensaio de potência. Entretanto, mais estudos são necessários. Tuberculosis remains the world’s leading cause of mortality. BCG is the only vaccine against TB approved throughout the world, presenting good cost-effective for the prevention of disseminated forms of tuberculosis in children. However, the protection provided by BCG is considered limited when it comes to prevent the pulmonary form in adults. Regarding the quality control of BCG production there is deficiency of assays that indicate directly the protective efficacy of the vaccine. Today, the CFU assay is used to estimate the number of viable bacteria and has been used as a substitute for a potency test. This study proposes an in vitro assay using dendritic cells, as the first line of immune response, to evaluate the potency of BCG vaccine. For this, we used in vitro differentiated moDCs from isolated PBMC’s monocytes. For monocytes isolation and moDCs differentiation were tested difents techniques and culture media, respectively. As result, the isolation technique of magnetic microspheres selection and cells culture in plate with RPMI cells, SH and concentration the 500 UI /ml each of GM-CSF and IL-4. Immature moDCs were infected as 3 different BCG lots (lot A-6.86 x 106 CFU/ml, lot B-2.48 x 106 CFU/ml and lot C 9.82 x 106 CFU/ml) in four dilutions (1:10, 1:20, 1:40 and 1:60) for 24 hours. For control DCs unstimulated (negative control), DCs stimulated with LPS (positive control) and BCG containing non-viable bacilli (irradiated BCG and irradiated + heated BCG) was used. After 24 hours, the surface markers CD14, CD1a, CD209, TLR2 and 4, CD80, CD86, CD40, CD83, HLA-DR, CCR7 were evaluated by flow cytometry. We measured the pro-inflammatory cytokines IL-12, IL-18, TNF-α, IL-1α and antiinflammatory cytokine IL-10 by ELISA. We performed CFU assay for observation of bacilli that was not internalized by moDCs. As a result, there was a decrease in CD14 expression, an increase of CD209, while CD1a expression did not change when the monocytes differentiated in moDCs. Moreover, the molecules CD80, CD86 and HLA-DR showed an increased of this expression in cells infected with BCG compared to immature DCs, whereas CD40 showed similar results or even a decreased expression in moDCs infected with BCG when compared to immature moDCs. Despite of these changes, there was no observed proportionality between the CFU number and the expression of most of these markers. Regarding cytokines, only TNF-α showed an increase in their level when moDCs were infected with BCG, as well as showed a proportional increase in the number of CFU and the dilution used. Finally, the CFU assay showed lower bacilli counts in supernatant from moDCs positive selection in comparison with negative selection. In addition, in same group, the number of bacilli present in the supernatant did not show proportionality with the initial CFU number of BCG. While the count in supernatant of moDCs derived from negative selection showed this proportionality. In conclusion, BCG was able to induce maturation moDCs in vitro. TNF-α and CD80 shown to be the most promising candidates for a future potency assay. Further studies, however, need to be performed.