Uma grande variedade de produtos de saúde vem sendo continuamente desenvolvida sendo necessária a avaliação da segurança para o consumidor final e o apoio ao desenvolvimento tecnológico de produtos para a saúde. Segundo a ISO 10993-5:2009, há vários métodos normatizados para a determinação da citotoxicidade de dispositivos médicos implantáveis, porém, diferente sensibilidade dentre os métodos vem sendo reportada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar comparativamente os ensaios de citotoxicidade in vitro recomendados pela ISO 10993-5:2009 em células L929 de fibroblastos de camundongo para a análise de material de prótese mamária de silicone visando identificar o método mais sensível e reprodutível. Foram utilizadas dezesseis (16) amostras de próteses mamárias de silicone de diferentes marcas e lotes e duas (2) amostras de silicone comercial (suporte de seio de silicone natural e protetor antiaderente de silicone industrial). O controle negativo utilizado foi um plástico atóxico – USP (Farmacopeia Americana) que é comprovadamente atóxico, e o controle positivo utilizado foi um garrote de látex tóxico. Foram analisados quatro métodos para determinação da citotoxicidade descritos na ISO 10993-5:2009: a) difusão em ágar; b) contato direto; c) eluição; d) captura de vermelho neutro. Os métodos testados foram considerados válidos, tendo o controle negativo mostrado ausência de reação citotóxica e o controle positivo mostrado forte reação citotóxica. Todas as amostras de prótese mamária (P1 a P16) mostraram ausência de reação citotóxica similar ao controle-negativo. Contudo, a toxicidade do controle positivo (látex), do suporte de seio de silicone natural e protetor antiaderente industrial não foram identificadas igualmente pelo método de difusão em ágar. Para o suporte de seio esse método identificou grau zero de toxicidade contra grau 4 dos outros métodos; para o látex e o protetor antiaderente industrial, a diferença para a toxicidade prevista foi de 3 no método de difusão contra 4 nos outros. Deste modo, destaca-se a menor capacidade preditiva do método de difusão em ágar nas condições testadas no presente estudo. Embora seja inegável a importância dos testes com culturas celulares podendo ser utilizados com sucesso, por serem reproduzíveis, rápidos, sensíveis e financeiramente acessíveis para a execução do estudo de biocompatibilidade in vitro, a escolha do método in vitro mais adequado ao teste de toxicidade de materiais como próteses mamarias tem um papel fundamental na segurança dos usuários sem deixar de lado a execução de uma ciência mais ética e confiável. Com base nos resultados obtidos em relação aos quatro testes de citotoxicidade in vitro utilizados foi possível concluir que as próteses mamárias testadas foram atóxicas, porém, para o polímero utilizado no suporte de seio, houve diferença significativa entre os resultados no método de difusão em ágar e de captação de vermelho neutro em relação aos métodos de contato direto e de eluição.Wide variety of health products has been continuously developed, requiring the assessment of safety for the end consumer and supporting the technological development of health products. According to ISO 10993-5: 2009, there are several standardized methods for determining the cytotoxicity of implantable medical devices, however, different sensitivity among the methods has been reported. Thus, the objective of this work was to comparatively evaluate the in vitro cytotoxicity assays recommended by ISO 10993-5: 2009 in mouse fibroblast L929 cells for the analysis of silicone breast implant material in order to identify the most sensitive and reproducible method. Sixteen (16) samples of silicone breast implants of different brands and lots and two (2) samples of commercial silicone (natural silicone breast support and industrial silicone nonstick protector) were used. The negative control used was a nontoxic plastic (USP) that is demonstrated to be non-toxic, and the positive control used was a toxic latex stick. Four methods for determining the cytotoxicity described in ISO 10993-5: 2009 were analyzed: a) diffusion in agar; B) direct contact; C) elution; D) capture of neutral red. The methods tested were considered valid, the negative control showed absence of cytotoxic reaction and the positive control showed strong cytotoxic reaction. All samples of mammary prosthesis (P1 to P16) showed absence of cytotoxic reaction similar to the control-negative one. However, the toxicity of the positive control (latex), natural silicone breast support and industrial nonstick protector were also not identified by the agar diffusion method. For breast support this method identified grade zero toxicity against grade 4 of the other methods; for the latex and the industrial nonstick protector, the difference for the predicted toxicity was 3 in the diffusion method against 4 in the others. Thus, the lower predictive capacity of the diffusion method in agar under the conditions tested in the present study stands out. While the importance of cell culture testing can be undoubtedly successful and reproducible, rapid, sensitive and financially accessible for the in vitro biocompatibility study, the choice of the most appropriate in vitro method for the test of material toxicity As breast prostheses plays a fundamental role in the safety of users without leaving aside the execution of a more ethical and reliable science. Based on the results obtained in relation to the four in vitro cytotoxicity tests used, it was possible to conclude that the mammary prostheses tested were nontoxic, however, for the polymer used in the breast support, there was a significant difference between the results in the agar diffusion method and of neutral red uptake in relation to direct contact and elution methods.