Dissertation
Participação da via AGE-RAGE nas alterações hepáticas decorrentes da diabetes e da síndrome metabólica
Registration in:
PEREIRA, Evelyn Nunes Goulart da Silva. Participação da via AGE-RAGE nas alterações hepáticas decorrentes da diabetes e da síndrome metabólica. 2017. 120 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017.
Author
Pereira, Evelyn Nunes Goulart da Silva
Abstract
Diversas evidências apontam para o envolvimento da via AGE-RAGE em complicações hepáticas de diferentes etiologias, além de serem participantes fundamentais em lesões vasculares em várias doenças, incluindo diabetes e Alzheimer, mostando que o acúmulo de AGEs no fígado pode participar do dano microvascular hepático, agravando ainda mais a disfunção hepática. Para investigar o envolvimento desta via nas alterações hepáticas decorrentes da diabetes e da síndrome metabólica, nossos estudos foram divididos em duas partes. No primeiro, exploramos a patogênese das alterações hepáticas que ocorrem no diabetes e a modulação dessas complicações pela tratamento combinado de metformina e insulina. Para este fim, ratos diabéticos foram tratados com insulina (DM + Ins) ou metformina + insulina (DM + Met + Ins). Os parâmetros bioquímicos e cardiometabólicos foram analisados por espectrofotometria. Microscopia intravital foi utilizada para estudar a microcirculação hepática. No tecido hepático, analisamos a expressão gênica de enzimas envolvidas no estresse oxidativo, marcadores inflamatórios e do receptor para produtos finais de glicação avançada (AGE) (RAGE). A peroxidação lipídica foi avaliada por análises de TBARs. A deposição de AGEs e a expressão de RAGE foram avaliadas por espectrofotometria de fluorescência e Western blot, respectivamente. O peso corporal, %HbA1c, ureia, proteínas totais e parâmetros de estresse oxidativo foram melhorados de forma semelhante pelos tratamentos com insulina ou Met + Ins Por outro lado, o tratamento com Met + Ins mostrou um efeito mais pronunciado sobre o nível de glicose no sangue em jejum do que a monoterapia com insulina. Os níveis de frutosamina, ácido úrico, creatinina, albumina e amilase e a dose de insulina diária só foram melhorados pelo tratamento combinado. Os marcadores de disfunção hepática, renal e pancreática foram mais afetados positivamente pela terapia combinada de metformina quando comparados ao tratamento com insulina. O dano na microcirculação hepática foi completamente protegido pelo tratamento com Met + Ins, enquanto que a monoterapia de insulina não mostrou nenhum efeito. Nossos resultados sugerem que o estresse oxidativo, o dano microcirculatório e proteínas glicadas podem estar envolvidos na etiologia da doença hepática decorrente da diabetes. Além disso, o tratamento combinado de metformina melhorou o comprometimento sistêmico e hepático induzido pela diabetes, mostrando um efeito mais pronunciado do que a monoterapia com insulina. Na segunda análise, estudamos a fisiopatologia da disfunção microcirculatória hepática na doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). Para isso, o modelo NAFLD foi induzido em ratos Wistar, por 20 semanas de dieta hiperlipídica (HFD). O rolamento e adesão de leucócitos e a perfusão tecidual na microcirculação hepática foram examinados utilizando microscopia intravital e laser speckle (LSCI), respectivamente O estresse oxidativo e os parâmetros inflamatórios foram analisados por TBARs, a atividade enzimática da catalase, RT-PCR e ELISA. A participação de AGE e RAGE foi avaliada pela expressão gênica e proteica de RAGE por RT-PCR e Western-blot, respectivamente, e por quantificação hepática e sérica de AGEs fluorescentes. Os ratos Wistar alimentados com dieta HFD mostraram aumento do teor de gordura abdominal e epididimal, pressão arterial sistólica, níveis de glicemia em jejum, triglicerídeos hepáticos e colesterol, e comprometimento do metabolismos de glicose e insulina. A histologia do fígado confirmou a presença de esteatose e a análise de ultrassom revelou aumento do tamanho do fígado e ecogenicidade parenquimatosa em ratos alimentados com HFD. HFD provoca aumentos significativos no rolamento e adesão de leucócitos microcirculação hepática e diminuição no fluxo sanguíneo microvascular do fígado. O tecido do fígado apresentou aumento do estresse oxidativo e inflamação. Às 20 semanas, houve um aumento significativo no conteúdo de AGEs no fígado e soro de ratos alimentados com HFD, além de um aumento na expressão do gene RAGE no fígado. Em conclusão, o aumento dos níveis de AGE no fígado e distúrbios microcirculatórios podem desempenhar um importante papel na patogênese da lesão hepática, e são componentes chave da NAFLD. Several evidences point to the involvement of the AGE-RAGE pathway in hepatic complications of different etiologies, as well as being fundamental participants in vascular lesions in several diseases, including diabetes and Alzheimer's disease, showing that the accumulation of AGEs in the liver can participate in liver microvascular damage, further aggravating hepatic dysfunction. To investigate the involvement of this pathway in the hepatic alterations due to diabetes and the metabolic syndrome, our studies were divided into two parts. In the first, we have explored the pathogenesis of the hepatic alterations which occur in diabetes and the modulation of these complications by the combination of metformin adjunct treatment and insulin monotherapy. For this purpose, diabetic rats were treated with insulin (DM + Ins) or metformin plus insulin (DM + Met + Ins). Biochemical and cardiometabolic parameters were analysed by spectrophotometry. Intravital microscopy was used to study the hepatic microcirculation. In the liver tissue, real-time PCR was used to analyse oxidative stress enzymes, inflammatory markers and receptors for advanced glycation end products (AGE) (RAGE) gene expression. Lipid peroxidation was assessed by TBARs analyses. AGE deposition and RAGE protein expression were studied by fluorescence spectrophotometry and Western blot respectively Body weight, %HbA1c , urea, total proteins and oxidative stress parameters were found to be similarly improved by insulin or Met + Ins treatments. On the other hand, Met + Ins treatment showed a more pronounced effect on fasting blood glucose level than insulin monotherapy. Fructosamine, uric acid, creatinine, albumin and amylase levels and daily insulin dose requirements were found to be only improved by the combined Met + Ins treatment. Liver, renal and pancreatic dysfunction markers were found to be more positively affected by metformin adjunct therapy when compared to insulin treatment. Liver microcirculation damage was found to be completely protected by Met + Ins treatment, while insulin monotherapy showed no effect. Our results suggest that oxidative stress, microcirculatory damage and glycated proteins could be involved in the aetiology of liver disease due to diabetes. Additionally, metformin adjunct treatment improved systemic and liver injury in induced diabetes and showed a more pronounced effect than insulin monotherapy. In the second analysis, we have studied the pathophysiology of hepatic microcirculatory dysfunction in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). For this, NAFLD model was induced in Wistar rats, by 20 weeks of high-fat diet (HFD) feeding Rolling and adhesion of leukocytes and tissue perfusion in hepatic microcirculation were examined using in vivo microscopic and laser speckle contrast imaging (LSCI), respectively. Oxidative stress and inflamatory parameters were analysed by TBARs, catalase enzyme activity, RT-PCR and ELISA. The participation of AGE and RAGE was evaluated by the measurement of gene and protein expression of RAGE by RT-PCR and Western-blot, respectively and by liver and serum quantification of fluorescent AGEs. Wistar rats fed high-fat diet (HFD) showed increase in epididymal and abdominal fat content, systolic arterial blood pressure, fasting blood glucose levels, hepatic triglycerides and cholesterol, and impairment of glucose and insulin metabolisms. Liver histology confirmed the presence of steatosis and ultrasound analysis revealed increased liver size and parenchymal echogenicity in HFD-fed rats. HFD causes significant increases in leukocyte rolling and adhesion on hepatic microcirculation and decrease in liver microvascular blood flow. Liver tissue presented increase in oxidative stress and inflammtion. At 20 weeks, there was a significantly increase in AGE content in the liver and serum of HFD-fed rats and an increase in RAGE gene expression in the liver. In conclusion, the increase in liver AGE levels and microcirculatory disturbances could play a role in the pathogenesis of liver injury and are key components of NAFLD.