O possível risco à saúde pública associado à presença de resíduos de antibióticos no leite é bastante discutido na literatura científica, porém, há poucas informações sobre os efeitos dos processamentos térmicos sobre a tilosina - antibiótico da classe dos macrolídeos - em concentrações residuais. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes temperaturas e tempos de aquecimento, reproduzindo as condições comerciais de processamento do leite, a fim de verificar se há redução na concentração dos resíduos, bem como a formação de produtos de degradação. A mesma avaliação foi efetuada em soluções padrão aquosas da substância. Um método analítico foi desenvolvido e validado para a determinação de tilosina em leite, baseado em uma extração QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) inovadora e na detecção por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial triplo quadrupolar (LC-MS/MS). O método possibilitou a determinação da tilosina A (principal componente da mistura de tilosinas A, B, C e D produzida por cepas de Streptomyces fradiae) e a detecção da tilosina B (segundo maior componente e produto de degradação da tilosina A em condições ácidas). A recuperação global da tilosina A em condições de precisão intermediária foi superior a 89,3%, com desvio padrão relativo inferior a 12% no intervalo de concentração de 25 a 75ng/mL. Os valores de CCα, CC, limite de detecção e de quantificação foram de 58,35ng/mL, 71,70ng/mL, 0,84ng/mL e 2,79ng/mL, respectivamente. Um espectrômetro de massas por tempo de voo (Triplo-TOF) também foi empregado para fins de elucidação estrutural, permitindo a identificação das tilosinas A, B, C e D e do produto de degradação DMT. Os dados obtidos foram tratados estatisticamente para a avaliação da estabilidade térmica da tilosina, expressa na forma de porcentagens de degradação. Os resultados mostraram que a tilosina é bastante resistente a diferentes temperaturas e tempos de aquecimento, tanto em solução aquosa quanto no leite, com uma perda máxima de concentração de 10,8% a 62°C por 30 minutos, 13,31% a 78°C por 30 segundos e 6,47% a 128°C por 4 segundos. A alta estabilidade da tilosina pode representar um significativo aumento do risco à saúde pública, uma vez que os resíduos deste antibiótico permanecem no leite mesmo após os processamentos térmicos comerciais.The likely risk to the public health associated to the presence of antibiotic residues in milk is much discussed in cientific literature. However there are few informations about the effects of thermal processing on tilosin, macrolide class antibiotic, in residual concentrations. The objective of this project was evaluate the effect of different temperatures and heating times, reproducing commercial conditions of milk processing so that to verify if there is reduction in residues concentration as well as in the formation of degradation products. The same evaluation was carried out in aqueous standard solutions of the substance. An analytical method was developed and validated for determination of tilosin in milk, based on an innovative QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) extraction and on detection by high performance liquid cromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The method has enabled determination of tilosin A (the main component of the mixture of tilosins A, B, C and D produced by strains of Streptomyces fradiae) and detection of tilosin B (second major component and degradation product of tilosin A in acid conditions). The overall recovery of tilosin A under intermediary precision conditions was higher than 89,3%, with relative standard deviation lower than 12% over the concentration range from 25 to 75ng/mL. The values of CCα, CCb, detection limit and quantification limit were 58,35ng/mL, 71,70ng/mL, 0,84ng/mL and 2,79ng/mL, respectively. A time-of-flight (TOF) mass spectrometer was also employed for purpose of structural elucidation allowing the identification of tilosins A, B, C and D and other degradation products. The obtained data were statistically treated for the evaluation of heat stability of tilosin expressed in degradation percentages form. The results have showed that tilosin is very resistent to different temperatures and heating times both in aqueous solution as in milk, with maximum loss of 10,8% at 62°C for 30 minutes and 13,31% at 78°C for 30 seconds and 6,47% at 128°C and 4 seconds. The high stability of tilosin can represent a siginificative rising of risk to the public health since residues of this antibiotic remain in milk even after commercial thermal processing.