Caracterização da peptidase GP63 em L. tarentolae

Abstract

Leishmania tarentolae é uma espécie de Leishmania isolada de répteis e não patogênica ao homem. Esta espécie é amplamente utilizada como modelo de expressão de proteínas em eucariotos. Em função da rápida proliferação em cultura e a facilidade de manejo laboratorial, L. tarentolae tem sido empregada como modelo de estudos bioquímicos, moleculares e ultraestruturais. Em 2012, o genoma completo de uma cepa de L. tarentolae foi sequenciado, e dentre diversos dados reportados, destacamos a expansão gênica de um importante fator de virulência, a GP63. A expansão gênica foi correlacionada com a ausência de atividade proteolítica desta peptidase, que não fora detectada nas condições ensaiadas. A GP63 é uma glicoproteína com atividade de metalopeptidase, dependente de zinco, com altos níveis de expressão nas formas promastigotas do gênero Leishmania, e com homólogos ativos em diversos tripanossomatídeos monoxênicos e espécies do gênero Trypanosoma. A GP63 pode ser encontrada na superfície celular, ligada a uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI), podendo ainda ser encontrada na sua forma solúvel dentro de vesículas, onde também está ancorada à membrana das vesículas, ou secretada. Este trabalho está centrado na hipótese que existe uma GP63 proteoliticamente ativa em L. tarentolae. Nesse sentido, através da técnica de zimografia (SDS-PAGE-caseína) e ensaios fluorimétricos com Gelatina-FITC, demonstramos a presença de uma proteína que migra na faixa de 60 kDa, que apresenta atividade proteolítica e é inibida por 1,10-fenantrolina e EDTA. Através de Western blotting, detectamos uma proteína migrando nesta faixa de massa molecular que apresentou reação cruzada com o anticorpo anti-gp63 de Leishmania mexicana Os níveis de GP63 foram avaliados por citometria de fluxo e Western blotting, e curiosamente, não houve variação significativa em relação a Leishmania braziliensis. Por fim, analisamos o genoma de L. tarentolae, e selecionamos um gene para clonagem e super-expressão (+GP63Lta), bem como um gene de GP63 de Leishmania major (+GP63Lmj), que foi selecionado por ter a estrutura tridimensional resolvida por cristalografia, e estar bioquimicamente bem caracterizada. Os mutantes foram comparados quanto ao perfil proteolítico e localização celular da GP63. O mutante +GP63Lta apresentou um discreto aumento na atividade proteolítica em relação a cepa selvagem, enquanto que +GP63Lmj apresentou um halo de degradação intenso, comparável a espécies patogênicas de Leishmania. Não detectamos diferenças significativas no perfil de distribuição celular entre cepas selvagem e mutante. Nossos próximos passos incluem a análise do comportamento biológico entre essas cepas, como perfil de crescimento em cultura, infecção in vitro de macrófagos e células de inseto e infecção in vivo de flebotomíneos e camundongos, além da purificação da GP63 de L. tarentolae para caracterização bioquímica detalhada. Estes dados contribuirão para o conhecimento acerca das funções biológicas da GP63 na família Trypanosomatidae.