Caracterização funcional de quitinases de Rhodnius prolixus

Abstract

Quitinases são enzimas responsáveis pela hidrólise de ligações glicosídicas no interior de cadeias de quitina. Em insetos, elas estão relacionadas ao remanejamento da quitina durante o desenvolvimento e ecdise, na digestão de insetos detritívoros e predadores, e no controle da espessura da membrana peritrófica intestinal. As quitinases de insetos descritas até o momento pertencem à família 18 das glicosídeo hidrolases. O Rhodnius prolixus é um dos principais vetores da doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi. No genoma de R. prolixus são encontrados 9 genes de quitinases, mas o papel dos transcritos correspondentes ainda não foi estudado em detalhe. O objetivo deste trabalho é o estudo detalhado da expressão dos transcritos de quitinase de R. prolixus e análise de seu papel fisiológico através do silenciamento por RNAi. O conhecimento do papel de quitinases neste inseto pode revelar novos alvos para controle do vetor, assim como revelar novos aspectos de sua fisiologia e da interação entre o inseto e microrganismos Através de análises filogenéticas das sequências codificantes de quitinases, foi constatado que esses genes pertencem à diferentes grupos da família 18 das glicosídeo hidrolases, já descritos em outros insetos. Para estudo funcional verificou-se o efeito do silenciamento da expressão desses genes utilizando RNAi. Foi realizada uma curva de concentração injetando quantidades crescentes de dsRNA nos insetos (1\03BCg, 3\03BCg, 6\03BCg e 2 x 3\03BCg) a fim de definir qual a menor concentração que permitiria obter uma maior porcentagem de silenciamento para os diferentes genes GH18. Com base nos resultados obtidos o gene RpCht7 foi escolhido para análise dos fenótipos, pois apresentou uma alta taxa de silenciamento. O silenciamento do gene RpCht7 dobrou a mortalidade de insetos em jejum quando comparado ao controle injetado com dsGFP, mas não alterou a ingestão sanguínea, diurese, digestão, porcentagem de muda, defeitos na muda, razão sexual, tempo médio de eclosão e porcentagem de eclosão dos ovos postos. Entretanto, foi observada uma alteração na oviposição, uma vez que as fêmeas silenciadas para esse gene colocam 34% ovos a menos que os controles. As diferenças na postura de ovos ocorrem de 14 a 20 dias após a alimentação sanguínea. Dessa forma, fica inferido que o gene RpCht7 tem um papel importante na reprodução e pode ser um alvo promissor pra manipulação da aptidão vetorial de R. prolixus