Thesis
Avaliação de biomarcadores de gravidade em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum classificados clinicamente e estratificados quanto à carga parasitária em estudos de corte transversal.
Fecha
2017Registro en:
SOLCÀ, M. da S. Avaliação de biomarcadores de gravidade em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum classificados clinicamente e estratificados quanto à carga parasitária em estudos de corte transversal. 2017. 151 f. il. Tese (Doutorado em Patologia Humana) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Gonçalo Moniz, Salvador, 2017.
Autor
Solcà, Manuela da Silva
Institución
Resumen
INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral (LV) é, principalmente, causada pelo
protozoário Leishmania infantum nas Américas, podendo acometer o Homem e
animais. Dentre estes, o cão é considerado o principal reservatório doméstico do
parasito. O curso da LV canina (LVC) varia entre os animais, podendo alguns se
mostrar resistentes à infecção, se mantendo subclínicos, e outros susceptíveis, que
irão desenvolver sinais da doença. O estado de resistência ou susceptibilidade à
LVC reflete na gravidade da infecção do animal, e não pode ser definido pelo quadro
clínico apresentado ou por qualquer parâmetro isolado de resposta imune.
OBJETIVO: Avaliar a carga parasitária como biomarcador parasitológico, as
proteínas LJM11/LJM17 como biomarcadores de exposição à saliva do vetor, e
identificar biomarcadores inflamatórios de gravidade da infecção por L. infantum em
cães. Primeiramente, foi realizada a padronização de uma ferramenta diagnóstica de
PCR quantitativa (qPCR), utilizando diferentes amostras biológicas (aspirado
esplênico, linfonodos, pele, sangue, medula óssea e swab conjuntival) de cães
sintomáticos provenientes da área endêmica de Jequié-BA. A avaliação da carga
parasitária de L. infantum teve seu desempenho comparado com outras técnicas
diagnósticas (cultura de aspirado esplênico, teste rápido e ELISA para LVC)
empregando a análise de classe latente (ACL). Para essa análise, foi construída
uma variável latente a ser empregada como padrão ouro para avaliação da acurácia
desses métodos. Na avaliação inicia dos cães sintomáticos, a qPCR detectou DNA
do parasita em 100% dos animais em pelo menos uma das amostras biológicas,
sendo que todos foram positivos empregando-se o aspirado esplênico e 70%
empregando-se o sangue. Utilizando a variável latente como padrão-ouro, a
sensibilidade para a qPCR de aspirado esplênico (95,8%) foi maior do que as
obtidas pela qPCR utilizando outras amostras biológicas e por outros testes
diagnósticos. Desta forma, em uma segunda etapa, a acurácia da qPCR
empregando-se aspirados esplênicos foi avaliada em uma amostra canina obtida de
forma randômica (n = 800), coletada durante um estudo de corte transversal na área
endêmica de Camaçari-BA. Utilizando a variável latente como padrão-ouro,
novamente a sensibilidade para a qPCR de aspirado esplênico foi elevada (95%).
Neste estudo de corte transversal foi possível também correlacionar a carga
parasitária com a gravidade da infecção, existindo associação positiva significativa
entre a intensidade da carga parasitária no baço e o número de sinais clínicos
presentes nos cães. Nessa primeira parte do estudo, foi possível demonstrar que i) a
utilização de aspirado esplênico na qPCR apresentou maior sensibilidade na
detecção de DNA de L. infantum do que outras amostras biológicas; ii) a ACL pode
ser usada para gerar um padrão ouro adequado para avaliação de técnicas
diagnósticas, uma vez que esta técnica oferece uma avaliação mais completa dos
resultados obtidos por diferentes métodos diagnósticos para LVC e iii) a carga
parasitária se mostrou um bom biomarcador de gravidade clínica nos animais
infectados por L. infantum. Posteriormente, após a reação de qPCR ter sido
padronizada e validada empregando-se aspirados esplênicos, esta foi aprimorada
para utilização em estudos epidemiológicos, sendo padronizada em formato duplex
tanto na forma líquida como no formato em gel (ready-to-use), adicionando-se à
reação primers específicos para a detecção simultânea de um gene constitutivo
canino. Esse protocolo permitiu a detecção de até 0,1 parasitas por amostra.
Adicionalmente, a detecção de DNA do hospedeiro na mesma reação
simultaneamente fortaleceu o diagnóstico da LVC, agindo como controle interno da
reação, reduzindo tempo de execução e diminuindo custos da reação. Após a
padronização da qPCR duplex, foi realizado um estudo exploratório de uma amostra
de cães coletada durante outro estudo de corte transversal, em Camaçari-BA, no
qual se objetivou avaliar biomarcadores de exposição à saliva do vetor (proteínas
LJM11/LJM17) e identificar biomarcadores inflamatórios, correlacionando-os à
gravidade da LVC e à carga parasitária. A análise identificou uma bioassinatura
distinta em cães com diferentes manifestações clínicas, caracterizada por uma
diminuição dos níveis de LTB4 e de PGE2 e um aumento de CXCL1 e CCL2, de
acordo com o agravamento da doença. Além disso, utilizando uma combinação de 3
parâmetros distintos (LTB4, PGE2 e CXCL1) como um marcador, este permitiu a
discriminação entre escores clínicos diferentes utilizando uma curva ROC. Foi
detectado também, que cães com escores clínicos elevados apresentaram-se, mais
frequentemente, positividade para anticorpos anti-saliva e elevadas cargas
parasitárias. Este estudo permitiu a avaliação e identificação de vários
biomarcadores em cães, que podem ser importantes para auxiliar na avaliação do
curso da doença e prognóstico por médicos veterinários, além de futuramente poder
ajudar na distinção entre cães resistentes ou susceptíveis direcionando estratégias
de controle da LVC em áreas endêmicas. CONCLUSÃO: Existem biomarcadores
parasitológicos como a carga parasitária, biomarcadores imunológicos e
inflamatórios como CXCL1, CCL2, LTB-4, PGE-2, além da produção de anticorpos
específicos contra as proteínas LJM 11 e LJM 17 da saliva do vetor, que são
capazes de diferenciar animais infectados por L. infantum de acordo com seus
diferentes quadros clínicos.