Proteínas recombinantes de amastigotas de Leishmania infantum

Abstract

O programa de controle da leishmaniose visceral no Brasil, através da eliminação de cães infectados com Leishmania, não produziu resultados satisfatórios. Além da baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos empregados e a demora entre a detecção e a eliminação de cães soropositivos, este tipo de medida enfrenta a pouca aceitação por médicos veterinários e donos dos cães. Apesar do encontro de cães na área endêmica com perfil dc resistência à infecção por Leishmania, sugerindo que uma vacina é possível, ate o presente momento não estão disponíveis vacinas humanas ou para uso veterinário, com eficácia comprovada. Este estudo teve como objetivo a padronização ou desenvolvimento de metodologias para a obtenção e avaliação de proteínas recombinantes de amastigotas de Leishmania infantun/chagasi, potencialmente candidatas a componentes de ensaios sorológicos para diagnóstico da LV humana e/ou canina ou de uma vacina para cães contra a infecção por L. Infantun/chagasi. Inicialmente foi estabelecida a melhor condição de cultivo axênico para obtenção de amasligotas extracelulares de três espécies distintas de Leishmania. Apesar de morfologicamente semelhantes às formas amastigotas intracelulares, as formas axênicas de L. infantum/chagasi não apresentaram homogeneidade quanto à viabilidade e infectividade, contrastando com o observado com as espécies L. braziliensis e L. amazonensis. Dessa forma, amastigotas purificados de baço de hamsters infectados foram utilizados para purificação do RNA e produção de uma biblioteca de cDNA de L. infantun/chagasi. Cinco antígenos recombinantes diferentes foram selecionados da biblioteca de cDNA utilizando uma mistura de soros de cães ou de pacientes com leishmaniose visceral. Os soros dos indivíduos infectados não reativos a esses antígenos foram utilizados para identificar novos clones recombinantes, constituindo uma nova abordagem para obtenção de antígenos com potencial de aumentar a especificidade de um ensaio imunodiagnóstico. A adição dos novos antígenos elevou significativamente a sensibilidade de um ensaio “dipstick” utilizado para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana em relação a um painel limitado de soros. Além da utilização de anticorpos produzidos na infecção natural à Leishmania, foram testados também protocolos de imunização de três espécies diferentes de animais para a obtenção de anticorpos reativos aos antígenos da biblioteca, potencialmente úteis na seleção ou em processos de purificação das proteínas recombinantes. Os anticorpos produzidos durante a infecção subclínica foram capazes de reconhecer indistintamente proteínas de promastigotas e de amastigotas, apresentando, entretanto, maior reatividade com as formas evolutivas intracelulares, sugerindo que a imunização através da infecção com promastigotas vivos é mais eficiente na indução da produção de anticorpos contra ambos estágios de vida da Leishmania do que a injeção de lisados de promastigotas. A infecção subclínica em cães também induziu eficazmente resposta imune celular contra antígenos totais e recombinantes de L. infantun/chagasi, como determinado pelos ensaios de linfoproliferação e teste de hipersensibilidade tardia. O protocolo de imunização com cães, testado neste trabalho, pode ser bastante útil na seleção e/ou com ensaios imunobiológicos de antígenos de Leishmania promissores para o desenvolvimento de vacinas e/ou métodos imunoterápicos.