Isolamento e caracterização de fibrócitos murinos e teste de sensibilidade de infecção pelo Trypanosoma cruzi

Abstract

Os fibrócitos são células de origem hematopoiética, com propriedades pró-inflamatórias semelhantes às dos macrófagos e propriedades de remodelamento teciduais dos fibroblastos. Diversas condições de cultivo in vitro têm sido usadas para gerar fibrócitos humanos, murinos e suínos. Os protocolos desenvolvidos por Bucala e colaboradores (1994) vêm sendo usados como base para esse cultivo, contudo, variações nesses protocolos vêm sendo realizadas para a melhoria na obtenção destes fibrócitos. A tripanossomíase americana ou doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, há mais de um século após sua descoberta, ainda é considerada um importante problema social e de saúde pública. A fibrose, uma das manifestações mais significativas da cardiopatia chagásica crônica, encontra-se associada a infiltrados inflamatórios e cardiomiócitos em degeneração. Evidências têm sugerido a participação de outras células neste processo, como células endoteliais e fibrócitos circulantes. Tem sido extensamente descrito na literatura que fibrócitos do sangue periférico, produtores de matriz extracelular, podem contribuir para o desenvolvimento de fibrose pulmonar, renal e cardíaca. Estas células estão significativamente aumentadas no coração de indivíduos acometidos por isquemia cardíaca, hipertensão e fibrilação atrial, o que nos leva a pensar que podem estar presentes também nas lesões fibróticas da cardiopatia chagásica crônica e que podem ser um alvo potencial para o tratamento da fibrose cardíaca Diante disso, o presente estudo padronizou um protocolo de obtenção e estabelecimento de fibrócitos murinos em cultura e investigou se o T. cruzi é capaz de infectar estas células. Desta forma, para padronização da obtenção dos fibrócitos, diferentes protocolos de obtenção de PBMCs, a partir de sangue periférico de camundongos Swiss Webster foram testados, assim como diferentes anticoagulantes, meios de cultura e suplementação com SFB. Após o estabelecimento do protocolo, investigamos a possibilidade de infecção dos fibrócitos pela cepa SC2005 de T. cruzi. Os resultados mostraram que o uso do EDTA como anticoagulante proporcionou uma melhor obtenção de PBMCs e o meio de cultura DMEM/F-12 sem SFB foi o melhor para o estabelecimento e diferenciação dos fibrócitos. A caracterização dos fibrócitos foi realizada por imunofluorescência com marcações para CD11b, CD45, colágenos I, III, IV e fibronectina, sendo apenas esta última negativa. Os ensaios de infecção celular pelo T. cruzi mostraram um aumento gradativo no número de células infectadas até 24h, e um aumento no número de amastigotas entre 2 e 72h. A avaliação da produção de óxido nítrico foi semelhante em fibrócitos infectados e não infectados. Concluímos que a obtenção dos fibrócitos a partir de PBMCs depende não só do processamento sanguíneo, como também da composição do meio utilizado no cultivo das células e que o T. cruzi é capaz de infectar essas células de forma progressiva, com multiplicação crescente do número de amastigotas intracelulares. Outros estudos devem ser realizados para embasar os efeitos da infecção por T. cruzi nestas células.