Dissertation
Análise de dados de sequenciamento de RNA voltados à comparação de expressão gênica visando a um melhor entendimento dos mecanismos de resistência aos antimoniai
Fecha
2017Registro en:
GONÇALVES, Leilane Oliveira. Análise de dados de sequenciamento de RNA voltados à comparação de expressão gênica visando a um melhor entendimento dos mecanismos de resistência aos antimoniais. 2017. 93 f. Dissertação (Mestrado em Ciências - Concentração Biologia Celular e Molecular)-Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Instituto René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2017
Autor
Gonçalves, Leilane Oliveira
Institución
Resumen
A origem do que hoje chamamos de Sequenciamento de Nova Geração foi
impulsionada pelo sequenciamento do genoma humano e pela necessidade de
inovações técnicas, tecnológicas e computacionais que reduzissem os custos e o
tempo de análise. Essa necessidade possibilitou de uma maneira sem precedentes o
aumento dos estudos de genômica e transcriptômica. O melhor entendimento do
transcriptoma de um organismo é essencial
para identificar e interpretar como a
maquinaria gênica atua nos processos biológicos. Um grupo de organismos de grande
interesse em saúde pública e causadores do conjunto de doenças negligenciadas
conhecidas como leishmanioses são
os parasitos protozoários do gênero
Leishmania
.
Anualmente, estima-se que aproximadamente 300 mil novos casos e 20 mil mortes
relacionadas à leishmaniose vi
sceral são registrados. O
tratamento das leishmanioses
é problemático devido principalmente à alta toxicidade dos antimoniais pentavalentes e
o surgimento de parasitos resistentes a esses compostos. Por fim, considerando que
esses parasitas são agentes etiológicos de uma importante doença negligenciada,
pesquisas que tragam novas perspectivas para o entendimento dos mecanismos de
resistência aos compostos antimoniais são de particular importância. Neste contexto,
analisamos comparativamente o transcriptoma de duas linhagens de
Leishmania
infantum
(MHOM/BR/74/PP75), uma selvagem (LiWTS) e outra resistente ao antimônio
trivalente (SbIII) (LiSbR) com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos
que possam estar associados aos mecanismos de
resistência. Para tanto, utilizamos a
plataforma de sequenciamento Illumina
HiSeq 2000 para o sequenciamento das
amostras. Parte do processo analítico env
olveu a reanotação funcional dos genes de
L.
infantum
JPCM5 que foi utilizada como cepa referência para o processo de
mapeamento das leituras geradas. As amostras foram avaliadas quanto à sua
qualidade com os programas Prinseq e FastQC. As sequências adaptadoras e de baixa
qualidade foram removidas utilizando o Trim
momatic. O TopHat2 foi utilizado para o
processo de mapeamento das leituras no genoma de
L. infantum
JPCM5 e o DESeq2
para a realização das anális
es estatísticas. Esse
pipeline
analítico e a busca por genes
que possuíssem um p-valor ajustado < 0.05 e um
fold-change
> 1.2 possibilitaram a
identificação de 719 genes diferencialment
e expressos (699 com regulação positiva e
20 com regulação negativa) quando comparamos a linhagem resistente tratada 0.06
mg de SbIII (LiSbR 0.06) com a linhagem LiWTS , e 779 genes diferencialmente
expressos (749 com regulação positiva e 30 com regulação negativa) quando
comparamos as linhagens LiSbR 0.06 e LiWTS 0.06, ambas tratadas com baixa dose
de antimônio. No entanto, não observamos nenhum gene diferencialmente expresso
quando comparamos as linhagens selv
agens tratadas e não tratadas com Sb
III
,
indicando ausência de transcrição gênica difer
encial devido ao estresse da droga. Além
disso, realizamos a classificação funcional dos produtos proteicos destes genes de
acordo com o
Pfam
. Observamos que grande parte desses genes codificam
chaperonas e proteínas relacionadas a estresse,
transportadores, prot
eínas estruturais,
proteínas envolvidas nos processos de ubiqu
itinação e processamento de DNA e RNA,
enzimas metabólicas (envolvi
das nos processos de proteólise, metabolismo de ácidos
graxos, carboidratos e proteínas, entre outras), controle do ciclo celular, proteínas que
atuam na mediação da interação com outras proteínas, proteínas com função
desconhecida na biologia de
Leishmania
spp. e proteínas hipotéticas. Neste estudo
observamos um conjunto de genes diferencialmente expressos em
L. infantum
evidenciando que o fenômeno de resistência desse parasito aos compostos antimoniais
é multigênico e complexo