Produção e caracterização cinética e molecular de L-asparaginases micobacterianas visando seu uso no tratamento da Leucemia Linfoide Aguda

Abstract

A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é a segunda causa de morte no mundo em crianças de 0 a 4 anos de idade. No tratamento da LLA emprega-se a enzima LAsparaginase (L-ASP) do tipo II, por possuir maior afinidade com seu substrato LAsparagina (L-Asn). Os medicamentos comerciais utilizados atualmente derivam de Escherichia coli ou de Erwinia chrysanthemi. À diferença das células normais, alguns subtipos de células LLA são incapazes de sintetizar L-Asn, pela perda da expressão da enzima asparagina sintetase (AS). A L-ASP é uma hidrolase que converte o substrato L-Asn em aspartato e amônia na presença de água. Quando administrada eficazmente, a enzima leva a uma diminuição do substrato no meio extracelular, à apoptose seletiva das células do tipo LLA e a uma cura definitiva de 80 a 90% das crianças e de 30 a 60% dos jovens e adultos. Porém, tais L-ASPs também apresentam atividade glutaminase, o que leva à diminuição da L-Glutamina (L-Gln) no sangue periférico ocasionando efeitos adversos no paciente, como pancreatite e problemas neurológicos. Observam-se também outros efeitos adversos causados por respostas imunológicas que podem levar à inativação da enzima e / ou a reações anafiláticas e, consequentemente, à parada ou modificação do tratamento, reduzindo assim a sobrevida dos pacientes. Por outro lado, vale ressaltar que atualmente no Brasil o acesso ao medicamento está muito dificultado devido ao desabastecimento, embora a L-ASP encontra-se listada entre os 10 produtos prioritários para o Sistema Único de Saúde (SUS) Os objetivos do trabalho foram estudar as características físico-químicas e biológicas e preparar uma base tecnológica para a engenharia genética de L-ASPs micobacterianas, incluindo a sua eventual expressão em um sistema alternativo Para isso, propomos o estudo das LASPs nativas de Mycobacterium smegmatis mc2155 (mc2155) e de 3 isolados micobacterianos da Coleção de Bactérias da Mata Atlântica (CBMA) (271, 293 e 294), em termos de caracterização e atividade enzimática. Para tal fim, as diferentes sequências foram amplificadas e clonadas no plasmídeo pET28a, que apresenta origem de replicação reconhecido por E. coli. Além disso, o gene da L-ASP derivado de mc2155 também foi clonado no plasmídeo pUS976, que apresenta origem de replicação reconhecido tanto por E. coli como por micobactérias, visando obter a produção da proteína de interesse de forma secretada para facilitar o processo de purificação. As construções obtidas com pET28a foram expressas em E. coli BL21(DE3) e as obtidas com pUS976 foram expressas em mc2155. Seguidamente foi realizada a indução da expressão das proteínas de interesse. Observou-se maior produção das L-ASPs derivadas de mc2155 e de 271 a temperatura ambiente após 24 horas e a 37 oC após 16 horas, respectivamente, em meio auto-induzível livre de glicose. Por outro lado, foi realizada uma modelagem comparativa da L-ASP de mc2155 empregando várias técnicas e foram identificados os resíduos do sítio catalítico. O trabalho desenvolvido fornece a base para posteriores estudos da atividade asparaginase e glutaminase e para a síntese de uma nova L-ASP otimizada e derivada da L-ASP nativa de mc2155, visando a redução ou eliminação de epítopos imunogênicos, a diminuição da atividade glutaminase e o aumento da atividade asparaginase.