Avaliação da contaminação pirogênica em soros hiperimunes e ambientes sujeitos a vigilância sanitária: comparação dos métodos in vitro e in vivo aplicados ao controle da qualidade

Abstract

A necessidade de substituição do Teste de Pirogênio em Coelhos (RPT, sigla do inglês Rabbit Pyrogen Test) no controle da qualidade de produtos injetáveis torna urgente o estabelecimento de métodos alternativos que possam substituí-lo. Devido às limitações do Teste de Endotoxina Bacteriana ou Lisado de Amebócitos do Limulus (LAL), o Teste de Ativação de Monócitos (MAT, sigla do inglês Monocyte Activation Test) foi implementado na Farmacopéia Européia. Entretanto, o MAT foi considerado apenas como um terceiro teste devido à falta de estudos em relação a comparação in vivo e in vitro para alguns produtos como os biológicos, assim como para pirogênios não endotoxinas. O objetivo deste estudo foi avaliar a aplicabilidade do MAT para soros hiperimunes e na resposta ao Zymosan comparando em paralelo com o modelo in vivo, assim como uma nova aplicação para ambientes comparando com a análise microbiológica. Desta forma, foram avaliados i. o uso do sangue criopreservado em relação ao fresco por doadores individuais e no pool tanto na contagem de diferentes tipos celulares, assim como na resposta de IL-1β em relação a Endotoxina, ii a aplicabilidade do MAT (IL-1β e Il-6) para 43 lotes de soros hiperimunes, assim como lotes contaminados artificialmente, através da determinação do limite de detecção (LD), da máxima diluição válida (MVD), do teste de interferentes, e da sensibilidade, especificidade e acurácia em relação ao RPT; iii aplicabilidade do MAT (IL-1β e Il-6) na detecção do Zymosan através da comparação em paralelo de amostras contaminadas artificialmente no RPT e no MAT, e iv aplicabilidade do MAT (IL-1β e Il-6) na detecção de pirogênios em amostras de ar em três laboratórios e dois escritórios, comparando com o método preconizado na legislação brasileira (contagem de fungos totais). Os resultados mostraram que a contagem de linfócitos/monócitos permaneceu estável durante o tempo de congelamento (-80ºC) e que o pool não interferiu na resposta a endotoxina. Além disso, o MAT apresentou alta sensibilidade (100%) e especificidade (87,5% para o Método A e 82,5% para o Método B), sendo mais sensível na detecção de soros hiperimunes do que o RPT. Os resultados do Zymosan seguiram a mesma tendência, onde o limite de febre encontrado no RPT foi de 5,000ng/mL e no MAT de 2,500ngmL-1. Este também foi capaz de detectar pirogênios em amostras de ar, variando entre 0,16 a 5,17 EUUmL-1 para IL-1β e de 0,49 a 5,70 EUUmL-1 para a IL-6 em estações frias e de 1,03 a 2,67 EUUmL-1 para IL-1β e de 1,10 a 2,67 EUUmL-1 para a IL-6 em estações quentes. Os resultados apresentados demonstraram que o MAT foi capaz de detectar e quantificar contaminações pirogênicas em soros hiperimunes, assim como pirogênios não endotoxina, podendo ser utilizado na rotina do controle da qualidade para estes produtos. Desta forma, os resultados deste estudo podem indicar a inclusão do MAT na Farmacopeia Brasileira para o controle da qualidade de soros hiperimunes, além de ser útil na tomada de decisão de órgãos internacionais em relação a substituição completa do RPT.