Tolerância bacteriana ao mercúrio relacionada com a atividade da enzima mercúrio redutase

Abstract

Estudos de tolerância ao mercúrio com Pseudomonas e exemplares da família Enterobacteriaceae sugerem que existe alguma ligação genética entre a resistência ao mercúrio e a resistência a alguns antibióticos, como ampicilina e estreptomicina. Pesquisas realizadas com bactérias resistentes ao mercúrio sugerem que a pressão seletiva ambiental e a transferência horizontal de genes, comum entre as bactérias, desempenharam um papel fundamental na distribuição da resistência ao mercúrio. A redução enzimática de mercúrio e de organomercuriais é o mecanismo de resistência mais bem estudado, ocorrendo em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, de origem ambiental ou clínica. Este mecanismo de resistência envolve o operon mer que codifica uma séria de proteínas, especialmente a enzima mercúrio redutase (MerA; EC 1.16.1.1), responsável pela redução catalítica do mercúrio. Bactérias com este gene estão envolvidas nos ciclos biogeoquímicos do mercúrio e podem ser usadas na sua biorremediação. Neste trabalho isolamos bactérias tolerantes ao mercúrio do meio ambiente das cinco regiões brasileiras na busca de um exemplar com potencial para uso em biorremediação. Para este uso é preciso ter como critérios de seleção que a bactéria tenha o gene merA e expresse a enzima MerA em quantidades apreciáveis. Neste trabalho foi possível isolar bactérias tolerantes a 5μM de mercúrio de todas as regiões do Brasil. Dentre as bactérias isoladas, foram selecionadas as amostras Gram-negativas com maior nível de tolerância ao Hg(II) e que demonstraram sensibilidade aos antibióticos mais comuns. Seguindo estes critérios, foi selecionada uma única amostra, identificada como Leclercia adecarboxilata M23, para investigar a relação entre a resistência ao mercúrio e os níveis de MerA. Os resultados mostraram que a determinação quantitativa desta enzima é um processo trabalhoso que ainda não está totalmente consolidado. Apesar do processo de lise celular não ter sido o mais adequado, os extratos celulares obtidos por agitação com pérolas de vidro permitiram demonstrar a presença de MerA nos extratos de L. adecarxilata M23 e de Escherichia coli ATCC 35218, amostras genotipadas por PCR como positivas para merA. Em contraste, no extrato da amostra de E.coli ATCC 23724, que não apresentou banda correspondente ao gene merA, não foi possível detectar qualquer atividade de MerA. A determinação de MerA pelo decaimento dos níveis de NADPH, medido através da absorção de luz a 340nm, gera problemas analíticos de difícil solução, já que o mercúrio reage com o NADPH mudando a sua absortividade neste comprimento de onda. Estas reações acontecem nos primeiros minutos de reação, implicando na necessidade de esperar algum tempo antes de considerar o decaimento da absorção de luz como uma medida quantitativa da atividade da enzima. Estes problemas podem ser contornados com a determinação da enzima pelo consumo de mercúrio iônico ou pela volatilização deste metal, até mesmo por células intactas, como pode ser demonstrado por avaliação de resultados da literatura. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a determinação quantitativa da atividade de MerA em extratos bacterianos não é um bom critério de seleção de bactérias para biorremediação. O comportamento de células em fase exponencial de crescimento expostas a concentrações crescentes de mercúrio, metodologia denominada neste trabalho como ―desafio com mercúrio‖, foi capaz de demonstrar que as amostras bacterianas MerA+ apresentam um comportamento diferente da amostra MerA-. O comportamento ideal de uma bactéria seria aquele capaz de tolerar a adição do mercúrio na fase exponencial de crescimento celular sem alteração da velocidade específica de crescimento, fato possível de ser encontrado na literatura, e que identificaria a amostra bacteriana com maior potencial para uso em biorremediação.