Combinação de Captura Dirigida e PCR na Detecção de Flebotomíneos Naturalmente Infectados por Leishmanias

Abstract

Os relatos sobre índice de infecção natural de flebótomos, por promastigotas de leishmania, em focos endêmicos de Leishmaniose Tegumentar Americana variam de 0 a 1,19%, o que, aparentemente não justifica a alta transmissão da doença. Na maioria das vezes, a técnica utilizada para detectar a infecção do flebótomo, é baseada na dissecção e exame do aparelho digestivo desses dípteros. Quando a captura foi direcionada para próximo de uma casa com um caso humano de infecção recente (mais ou menos 15 dias), foi encontrado 1 flebótomo positivo em 193 examinados. Decidimos então, utilizar a Reação de Polimerase em Cadeia para detecção de leishmania em flebotomíneos capturados no domicílio e peridomicílio, de casos recentes de leishmanioses, para avaliar a infecção natural de flebotomíneos, na área endêmica de Corte de Pedra, Bahia. Coletamos 4.027 fêmeas de flebotomíneos em 79 capturas e agrupamos em 335 amostras (10 ou 20 flebótomos por amostra). As amostras foram acondicionadas em criotubos e conservadas em nitrogênio líquido até a extração do DNA. Para as Reações de Polimerase em Cadeia, foram utilizados oligonucleotídeos que amplificam a região conservada da molécula do minicírculo da leishmania: 5 GGG G/TAG GGG CTG TCT GCG AA 3 e 5 GGC CCA CTA TAT ACC CCC 3 e 5 CCG CCC CTA TTA TAC ACC AAC CCC 3 . A sensibilidade da técnica de PCR para a detecção de leishmania foi avaliada testando culturas com 10, 100 e 1000 leishmania misturadas com 10 ou 20 flebótomos em cada tubo. O produto amplificado foi submetido a eletroforese em gel de agarose, corado pelo brometo de etidio, visualizado sob luz ultra violeta, e foi possível hibridizar com sondas para os subgeneros Viannia e Leishmania. Nós conseguimos detectar DNA de leishmania, em amostras, contendo aproximadamente, 10 parasitos com 10 ou 20 flebótomos. Os resultados obtidos em gel de agarose, mostraram 11 amostras positivas. Após a hibridização foram observadas um total de 30 amostras positivas (incluindo as 11 positivas no exame pela ultra violeta). Na hibridização, foram utilizadas sondas que correspondiam a moléculas clonadas dos segmentos do minicírculo de Leishmania (Viannia) panamensis, IPAN V, número de acesso no Gene Bank U19811 e Leishmania (Leishmania) amazonensis, MHOM/BR/73 M2269, número de acesso no Gene Bank U198/0. Na área do estudo ocorre a Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis. Considerando que em cada amostra positiva continha apenas um exemplar infectado, a proporção de flebótomos infectados foi 0.74% quando comparada ao número total de flebótomos examinados e 8,95% quando relacionada aos grupos de flebótomos. Esses resultados mostram que o uso da Reação de Polimerase em Cadeia em amostras coletadas próximas a casas de pacientes recentemente diagnosticados para leishmanioses, melhora a detecção de flebotomíneos infectados por leishmania, em áreas endêmicas e pode ser uma ferramenta útil para avaliar o padrão de infecção por leishmania.