Dissertation
Complexo gama-secretase em Trypanosoma cruzi: bases para o desenvolvimento de novos testes diagnósticos específicos e novos alvos quimioterapêuticos
Fecha
2012Registro en:
GRUSZKOWSKI, Carolina Conceição Bottino. Complexo gama-secretase em Trypanosoma cruzi: bases para o desenvolvimento de novos testes diagnósticos específicos e novos alvos quimioterapêuticos. 2012. 77 f. Dissertação (Mestrado em Ciências)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2012.
Autor
Gruszkowski, Carolina Conceição Bottino
Institución
Resumen
Os métodos de diagnóstico usados hoje para a Doença de Chagas, embora simples e de baixo
custo, podem apresentar baixas sensibilidade e especificidade ou reações cruzadas com outros patógenos. Da mesma forma, os medicamentos usados no tratamento apresentam severos efeitos colaterais. Dentre os vários alvos metabólicos sugeridos, as proteases têm sido apontadas como moléculas candidatas devido às suas particularidades.Recentemente o nosso grupo identificou duas aspartil proteases em T. cruzi: uma solúvel (Cruzipsina-Il) e outra membranar (Cruzipsina-I); entretanto, suas funções biológicas permaneceram desconhecidas. Os nossos resultados demonstram, pela 1 a vez, a existência de um complexo proteolítico membranar em T. cruzi com propriedades similares ao complexo y-secretase de outras células eucarióticas. Usando ferramentas de bioinformática localizamos em banco de dados as seqüências primárias de 3 das 4 proteínas do complexo (presenilina, nicastrina e Aph-l). Esta informação foi importante para caracterizarmos através de síntese paralela de peptídeos os epitopos B lineares das 3 proteínas usando soros de pacientes. A presenilina apresentou 10 epitopos majoritários, a nicastrina, 5 e a Aph-l, 10. Alguns epitopos foram selecionados por vários critérios e anticorpos anti-peptídeos obtidos em coelhos. O soro anti-peptídeo PRE-2 de presenelina identificou por immunoblotting a banda de 48 kDa na fração CZP-I como sendo presenelina, enquanto o soro anti-peptideo NIC-l de nicastrina apresentou também uma marcação na mesma posição. A análise por microscopia confocal em epimastigotas localizou as proteínas predominantemente nas regiões anterior e mediana das células. Além disso, as marcações mostraram-se mais fortes em células permeabilizadas, sugerindo a co-localização de ambas as proteínas nas membranas internas da célula. Um teste de ELISA empregando 4 peptídeos sintéticos da presenilina e nicastrina de T. cruzi apresentou sensibilidade e especificidade de 71,59% e 70,53%, respectivamente. Utilizando a extração diferencial com detergente e análise por EGPA-SDS após cromatografia de afinidade, confirmamos na cepa CL Brener de T. cruzi o perfil de bandas presentes na cepa Y, de 240, 56, 48 e 34 kDa na fração CZP-I (detergente) e 56, 52, 37 e 34 kDa na fração CZP-I1 (solúvel). Ensaios
enzimáticos usando o inibidor L-685,458 e moduladores alostéricos DAPT e Composto
XXIIE da presenilina humana sugeriram que aparentemente o sítio catalítico da presenilina de T. cruti possui uma constituição semelhante. ao da presenilina humana, enquanto diferenças significativas puderam ser observadas no sitio alostérico. O inibidor de sítio ativo L-685,458 foi capaz de inibir 100% da atividade enzimática em 5!-lM, enquanto os moduladores DAPT e Composto XXIIE não apresentaram uma inibição significativa. Portanto, os nossos estudos sugerem que devido as suas funções enzimáticas e localização celular a presenilina do T. cruzi é um bom alvo quirnioterapêutico e imunológico.