Avaliação do 17-AAG como agente leishmanicida e seu mecanismo de ação na indução da morte de parasitos do gênero Leishmania spp.

Abstract

A leishmaniose é uma doença endêmica no Brasil causada por parasitos protozoários do gênero Leishmania. A quimioterapia continua sendo a forma mais efetiva de tratamento com os antimoniais pentavalentes sendo usados há mais de 70 anos como a primeira linha de tratamento. O uso deste e de outros fármacos apresenta efeitos adversos graves, os esquemas terapêuticos empregados são desconfortáveis, além de relatos do aumento de casos de resistência. A proteína de choque térmico 90 (HSP90) é um membro da família das chaperonas presente em células eucarióticas e bactérias. Essa proteína é fundamental para o dobramento e estabilização de diferentes proteínas, chamadas genericamente de proteínas cliente. Essa chaperona vem sendo considerada um importante alvo molecular para o tratamento de diferentes doenças parasitárias. Nessa tese, o inibidor específico da atividade ATPásica da HSP90, o 17-allilamino-17-demethoxigeldanamicina (17- AAG) foi testado em parasitos do gênero Leishmania. Inicialmente, avaliamos o efeito em cultura axênica e observamos que o 17-AAG causa a morte desses parasitos em concentrações inferiores às necessárias para causar a morte de macrófagos. Observamos também que o tratamento com 17-AAG promove a morte intracelular dos parasitos em concentrações que variam de 25 a 500 nM nos tempos de 24 e 48 h, sendo também eficaz contra a forma amastigota em tempos mais tardios como 96 h de infecção. Os parasitos morrem independentemente da produção de moléculas microbicidas pelo macrófago, como superóxido e óxido nítrico, que tiveram sua produção reduzida em 61 e 58 %, respectivamente. O tratamento com 17-AAG também reduziu a produção de mediadores próinflamatórios como TNF-α, IL-6 e MCP-1 em 35, 35 e 92 %, respectivamente. Utilizando o modelo de camundongos BALB/c infectados por Leishmania braziliensis na orelha demonstramos que o tratamento com 17-AAG causou redução do tamanho da lesão cutânea em 0,5 mm e da carga parasitaria no local da infecção em 25 %, no entanto, não foi capaz de reduzir a carga parasitaria no linfonodo drenante. Análise por microscopia eletrônica de transmissão de macrófagos infectados e tratados com 17-AAG revelou alterações características de um processo autofágico com vacuolização do citoplasma e formação de vacúolos com dupla membrana, além da presença de figuras de mielina. Utilizando parasitos transgênicos observamos que 17-AAG induz um aumento de 30 % na formação de autofagossomos, que tem a sua capacidade de fusão com glicossomos e lisossomos reduzida. Além disso, parasitos ATG5 knockout, incapazes de formar autofagossomos foram cerca de 90% mais resistentes à morte induzida pelo AAG em relação a parasitos selvagens. Observamos, também, que o tratamento com MG132, um inibidor da atividade do proteassoma, assim como o 17-AAG induziu o acúmulo de proteínas ubiquitinadas de parasitos, especialmente em 8 parasitos incapazes de formar autofagossomos, sugerindo um papel da autofagia na degradação de proteínas ubiquitinadas. Por último, observamos que o MG132 foi capaz de induzir a formação de autofagossomos sugerindo uma ligação entre o acúmulo de proteínas ubiquitinadas e a indução da via autofágica. Em conjunto, nossos resultados indicam que o HSP90 é um alvo molecular que dever ser explorado no tratamento das leishmanioses.