Caracterização funcional de complexos mRNA-proteínas

Abstract

Em tripanossomatídeos a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível pós-transcricional. Acredita-se que a estabilidade do mRNA e o acesso aos polissomos sejam fortemente regulados, permitindo ao Trypanosoma cruzi uma rápida adaptação à diferentes condições ambientais as quais está exposto durante seu ciclo de vida. A regulação pós-transcricional requer uma associação entre mRNAs e determinadas proteínas formando complexos ribonucleoprotéicos (mRNPs). Nosso objetivo foi investigar a dinâmica de associação entre os mRNAs e proteínas, isolando e caracterizando proteínas e complexos protéicos ligados a mRNAs poliA+ das frações polissomal e pós-polissomal de epimastigotas em fase exponencial de crescimento e epimastigotas sujeitos a estresse nutricional. As amostras obtidas foram analisadas por espectrometria de massas (LC-MS/MS) e posteriormente comparadas. Nós identificamos 542 proteínas e dentre essas 24 estavam presentes em todas as frações analisadas, enquanto que outras eram exclusivas de uma fração específica: epimastigota frações polissomal (0,37%) e pós-polissomal (2,95%); estresse frações polissomal (13,8%) e pós-polissomal (40,78%). Proteínas sabidamente envolvidas com metabolismo de mRNA foram identificadas, sendo que esse resultado é importante para confirmar a confiabilidade da nossa técnica de isolamento das mRNPs. Essa abordagem em larga escala possibilitou uma análise mais completa da composição dos mRNPs e a dinâmica durante o estresse nutricional em T. cruzi. A partir dos dados obtidos nós selecionamos 6 proteínas para caracterização: fator de elongação 1-alfa (EF1-), proteína de ligação a RNA com domínio dedo de zinco (ZF-211.70), proteína de ligação a RNA com domínio cold shock (CD-33.60), prostaglandina F 2 alfa sintase (PF2 S), prostaglandina F sintase (PFS) e uma proteína hipotética com domínio de fator de replicação A (Hip -11.150). Os anticorpos contra as proteínas EF1-, ZF-211.70, PF2S e PFS apresentaram reatividade específica com uma proteína única de tamanho esperado, já as proteínas CD-33.60 e Hip-11.150 apresentaram um reatividade baixa ou inexistente em extratos de epimastigotas e por isso não foram utilizadas para os ensaios posteriores. Ensaios de imunofluorescência, sedimentação de polissomos em gradiente de sacarose e expressão ao longo do ciclo de vida nos permitiu uma caracterização inicial das proteínas selecionadas, etapas importantes para aprofundarmos o estudo na regulação de expressão gênica em T. cruzi.