Estudo da aplicabilidade do teste de ativação de monócitos na detecção de pirogênios na vacina contra febre amarela

Abstract

A necessidade de alternativas ao uso de animais no teste de pirogênio é guiada pelo principio dos 3R’s, culminando na aceitação pela Farmacopeia Europeia (FE) do método alternativo in vitro, o Teste de Ativação de Monócitos (MAT). Respeitando esta premissa, o MAT utiliza como matriz, fontes de monócitos humanos sendo considerado um método promissor e eficiente por excluir riscos inerentes à extrapolação inter-espécies, detectar amplo espectro de pirogênios e suprir limitações dos testes atuais, i.e o Teste de Endotoxina Bacteriana (LAL) e o Teste de Pirogênio em coelhos (RPT). Apesar das vantagens abordadas, alguns obstáculos técnico-científico-regulatórios devem ser transpostos para a implantação efetiva do MAT na rotina industrial, em especial, de produtos biológicos. Neste contexto, o Laboratório de Controle de Qualidade de Bio-Manguinhos (Seção de Controle Biológico) em colaboração com o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), visando reforçar a melhoria nos ensaios de controle de qualidade e fortalecer cientificamente o uso dos testes alternativos seguindo os pré-requisitos regulamentados pelas farmacopeias, selecionou de seu portifólio como alvo de estudo, a vacina contra a febre amarela (VFA) como primeiro modelo de aplicabilidade do MAT em vacinas virais por: (1) ser o carro-chefe de Bio-Manguinhos, (2) apresentar processo de produção complexo, com fatores críticos de interferência como uso de vírus vivo e resíduos de componentes de processos (ovos embrionados) e (3) possibilitar potencial investigativo de outras fontes pirogênicas não detectadas pelo método descrito na monografia da vacina. Os métodos farmacopeicos descritos para o MAT utilizando IL-1/sangue criopreservado, IL-6/ sangue fresco e a proposta de método para rotina industrial utilizando IL-6/ sangue criopreservado, foram validados conforme requisitos da FE. A verificação produto-específica foi realizada com a VFA/10 doses e fatores interferentes avaliados através da máxima diluição válida. Após determinação da diluição, o método quantitativo foi aplicado aos lotes vacinais, com interpretação entre os sistemas de leitura e matrizes do MAT e LAL. Os dados mostram reprodutibilidade do teste utilizando diferentes doadores e medidores de pirogenicidade (IL-6/IL-1) frente ao estímulo da endotoxina. Após verificação da aplicabilidade do MAT à VFA com diluição 1:10, demonstramos que os sistemas utilizando sangue criopreservado (IL-1β/IL-6) respeitam os limites de recuperação da endotoxina e se mostraram mais adequados do que o sistema IL-6/sangue fresco. Os resultados quantitativos da resposta pirogênica no produto - determinada pelo MAT - correspondem àqueles observados pelo LAL. Os dados demonstram a aplicabilidade do MAT em vacinas, sendo o modelo VFA compatível com a utilização.