Desenvolvimento de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex em tempo real com curva de dissociação de alta resolução (HRM) para detecção simultânea e identificação de seis herpesvírus humanos

Abstract

Os vírus do herpes simples (HSV) 1 e 2, o vírus varicela-zoster (VZV), o vírus Epstein-Barr (EBV), o citomegalovírus (CMV), e o herpesvírus humano 6 (HHV-6) apresentam papel etiológico central nas infecções do sistema nervoso central (SNC), e a reação em cadeia da polimerase (PCR) é reconhecida como método de referência no diagnóstico destas infecções. Na literatura, há ensaios de PCR em tempo real que usam sondas do tipo TaqMan, que, embora apresentem alta especificidade, possuem alto custo e restrição do número de sequências alvo. Ensaios com corantes fluorescentes de DNA de dupla-fita permitem o acompanhamento da amplificação de DNA e posterior identificação de amplicons pela temperatura de dissociação (Tm). O corante mais utilizado neste tipo de análise, o SYBRGreen, gera variações na Tm entre as amostras, dificultando a identificação do amplicon. Corantes de DNA de terceira geração, como o EvaGree, têm resolvido esta limitação, pois se ligam de forma saturante ao DNA de dupla-fita, permitindo análises de dissociação com maior confiabilidade, incluindo curvas de dissociação com alta resolução (HRM). Portanto, este projeto teve como objetivo desenvolver PCR multiplex em tempo real para detecção e identificação destes seis herpesvírus. Para tal, iniciadores foram selecionados da literatura, testados in silico quanto à formação de dímeros e ao pareamento com sequências genômicas humanas e, posteriormente, testados em reações individuais com controles de DNA viral e em controles negativos com DNA humano ou água. Iniciadores que se mostraram específicos foram unificados em reação multiplex, e aqueles que geraram dímeros e amplificação inespecífica foram excluídos ou redesenhados As condições de reação foram definidas em ensaios individuais e multiplex, e as taxas de eficiência de amplificação definidas em curvas-padrão construídas com diluições seriadas dos controles de plasmídeos recombinantes contendo os alvos de cada um dos herpesvírus. Também foram definidos o limite detecção e a interferência d amplificação simultânea de dois alvos na detecção viral. Iniciadores para VZV, EBV, CMV e HHV-6 se mostraram específicos na PCR em tempo real, enquanto os iniciadores para HSV-1 e HSV-2 necessitaram de modificações na região 3’ para compor a PCR multiplex. A execução da PCR com etapa de anelamento/extensão a 70ºC, e o uso dos iniciadores a 17,5 pmoles/reação, com exceção dos iniciadores para HSV-1 e HSV-2, que foram utilizados a 10 pmoles, resultou em testes individuais e multiplex com taxas de eficiência entre 93% e 110%. As temperaturas de dissociação obtidas para os amplicons de HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV e Hhv-6 foram de 84,11ºC, 86,83ºC, 82,09ºC, 88,06ºC, 85,30ºC, 79,67ºC, respectivamente. Contudo, os ajustes realizados não foram suficientes para eliminar a formação de dímeros e/ou amplificação inespecífica na PCR multiplex, que ocorreram em faixa de temperatura próxima à Tm do amplicon de HHV-6, o que prejudicou a identificação deste alvo. A análise de curvas convencional e normalizada de HRM foi capaz de identificar os seis herpesvírus nos testes individuais de PCR, com exceção de HHV-6 na PCR multiplex. No entanto, ensaios de amplificação simultânea de dois tipos virais demonstraram que pode haver prejuízo na detecção de um dos alvos, o que é uma limitação inerente aos ensaios multiplex. A análise por curva convencional de HRM apresentou melhor performance em relação à normalizada, sendo obtidos limites de detecção de 100 cópias/reação Amostras com concentrações mais baixas de DNA, em que ocorrem a formação de dímeros e/ou amplificação inespecífica e variações na intensidade de fluorescência, apresentaram a identificação prejudicada na curva normalizada. Dessa forma, a PCR multiplex em tempo real estabelecida neste estudo foi capaz de detectar e identificar cinco tipos virais (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV e CMV). No entanto, para a identificação de HHV-6 ainda são necessários ajustes. Com isso, esta PCR multiplex em tempo real pode ser aplicada no diagnóstico qualitativo, para triagem de amostras, e as reações individuais podem ser utilizadas de forma quantitativa