Efeito dos hormônios esteroides e seus antagonistas na modulação do sistema renina-angiotensina-aldosterona em células mesangiais humanas imortalizadas

Abstract

As células mesangiais (CM) desempenham um importante papel na manutenção da integridade do glomérulo e participam do processo de filtração glomerular. Essas células são capazes de sintetizar diferentes moléculas incluindo hormônios e os componentes do Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona (SRAA). Os hormônios esteroides participam de vários processos metabólicos e são capazes de modular a atividade de diferentes tipos celulares. No presente estudo avaliamos o papel da aldosterona (Aldo) e dexametasona (Dexa), assim como de seus respectivos antagonistas – espironolactona (Spi) e mifepristona (Mife) - na modulação da atividade das enzimas do SRAA e nas possíveis alterações fisiológicas das células mesangiais humanas imortalizadas (CMHI). A cultura de CMHI foi dividida em dois grupos de estudo. O primeiro grupo inclui: controle (apenas meio de cultura), estímulo com angiotensina II (1 μM, Ang II), antagonista da aldosterona (10 nM de espironolactona, Spi), aldosterona (10 nM, Aldo), dexametasona (10 nM, Dexa), aldosterona + dexametasona (10 nM, Aldo+Dexa) e o antagonista da dexametasona (10 nM de mifepristona, Mife). O grupo dois inclui o controle (apenas meio de cultura), e os grupos com a combinação dos antagonistas e drogas na concentração final de 10nM cada. Espironolactona + aldosterona (Spi+Aldo), espironolactona + dexametasona (Spi+Dexa), espironolactona + aldosterona + dexametasona (Spi+Aldo+Dexa), mifepristona + aldosterona (Mife+Aldo), mifepristona + dexametasona (Mife+Dexa), mifepristona + aldosterona + dexametasona (Mife+Aldo+Dexa). Foram realizados ensaios de viabilidade, adesão e migração celular, imunofluorescência para avaliar a expressão do colágeno tipo IV (CIV), ensaios enzimáticos de fluorescência utilizando substratos fluorogênicos para avaliar as atividades da enzima conversora de angiotensina (ECA), ECA2, neprilisina (NEP), renina e catepsina D (cat-D). A quantificação de peptídeos foi realizada através da espectrometria de massas. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento com antagonistas seguido de hormônios esteroides reduz a viabilidade das CMHI após 4 h de estímulo. A Spi per se aumenta a viabilidade e a capacidade adesiva das CMHI, mas não altera a capacidade de migração. Na presença da Aldo após estimulo com Spi, esta não foi capaz de manter a viabilidade das CMHI, mas manteve a capacidade de aderir e migrar de maneira semelhante ao controle. A mifepristona modula a expressão do CIV e na presença dos hormônios esteroides aumenta a capacidade adesiva dessas células. A atividade enzimática não demonstrou alterações com os diferentes estímulos, mas a quantificação dos peptídeos demonstrou que as diferentes interações entre hormônios e receptores altera o perfil peptídico nas CMHI, sugerindo papel importante dos hormônios esteroides e seus antagonistas na formação de diferentes angiotensinas. Estudos de sinalização ainda se fazem necessários a fim de elucidar a atividade desses hormônios/receptores em CMHI.

Mesangial cells are important for the maintenance of the glomerulus integrity and also have a role in the glomerular filtration. These cells are able to synthesize various molecules including hormones and Renin-Angiotensin-Aldosterone System (RAAS) components. Steroid hormones are involved in many metabolic process and can modulate the activity of different cell types. In this study we evaluated the role of aldosterone and dexamethasone, as well as its antagonists (spironolactone and mifepristone) in the modulation of RAAS enzymes and cell physiological alterations in immortalized human mesangial cells (IHMC). The IHMC culture was divided into two study groups. The first group includes: control (culture medium only), stimulation with angiotensin II (Ang II, 1µM), aldosterone antagonist (spironolactone - Spi, 10 nM), aldosterone (Aldo, 10nM), dexamethasone (Dexa, 10nM), aldosterone + dexamethasone (Aldo + Dexa, 10 nM each) and dexamethasone antagonist (Mifepristone – Mife, 10nM). The second group includes the control (only culture medium), and the groups with the combination of antagonists and drugs at a final concentration of 10nM each. Spironolactone + aldosterone (Spi + Aldo), spironolactone + dexamethasone (Spi + Dexa), spironolactone + aldosterone + dexamethasone (Spi + Aldo + Dexa), mifepristone + aldosterone (Mife + Aldo), mifepristone + dexamethasone (Mife + Dexa), mifepristone + aldosterone + dexamethasone (Mife + Aldo + Dexa). Viability, adhesion and cell migration assays were performed. Immunofluorescence assay was performed to evaluate collagen type IV (CIV) expression and enzymatic fluorescence assays using fluorogenics substrates were executed to analyse angiotensin converting enzyme (ACE), ACE2, neprilysin (NEP), renin and cathepsin D (cat-D) activity. The quantification of peptides was performed using mass spectrometry. Our results show that the pre-treatment with steroid antagonists followed with steroid stimulus reduces the viability of IHMC after 4 h of treatment. Spironolactone per se increases the viability and the adhesion capacity of IHMC, but did not induces alteration in migration response. In the presence of aldosterone, after Spi stimulation it reduces the viability but maintained the ability to adhere and migrate in a similar way to the control. Mifepristone modulates CIV expression and in the presence of steroid hormones improves the adhesive ability of IHMC. Enzymatic activity did not show alterations with different stimuli but quantification of peptides showed that different interactions between hormones and receptors alter the peptide profile in IHMC, suggesting an important role for steroid hormones and their antagonists in the formation of different angiotensins. Signalling studies are still necessary in order to elucidate the activity of these hormones/receptors.