Estudo da expressão das subunidades do Complexo Repressor de Polycomb 2 em epitélio olfatório e vomeronasal de camundongos

Abstract

Os receptores olfatórios (ORs) e os receptores vomeronasais (VRs) são expressos pelos neurônios olfatórios (OSNs) e neurônios vomeronasais (VSNs), respectivamente, e são responsáveis pela detecção precisa de diferentes moléculas no meio ambiente, o que é crucial para a sobrevivência dos animais. Esses receptores são membros das maiores famílias gênicas de mamíferos, codificados por centenas de alelos, e apresentam expressão monogênica e monolalélica nesses neurônios. Os OSNs apresentam uma arquitetura nuclear peculiar na qual a heterocromatina facultativa se concentra, frequentemente, ao redor de um bloco central de heterocromatina constitutiva. Os VSNs parecem apresentar a mesma organização da heterocromatina facultativa. O Complexo Repressor de Polycomb 2 (PRC2) é responsável pela trimetilação da lisina 27 da histona 3 (H3K27me3), que caracteriza a heterocromatina facultativa e leva ao silenciamento da transcrição gênica. PRC2 é formado por 3 principais subunidades, Ezh2/Ezh1, Suz12 e Eed, sendo Ezh2 e Ezh1 as subunidades catalíticas do complexo. Este projeto teve como objetivo caracterizar a expressão dos transcritos, por Hibridização In Situ de RNA, e das proteínas, por imunofluorescência, de Ezh2, Suz12, e Eed em epitélio olfatório de camundongo. Caracterizamos também, por imunofluorescência a expressão, de Ezh2 e Suz12 em epitélio vomeronasal de camundongos. Para realizar os ensaios de Hibridização in situ de RNA construímos os vetores e sintetizamos as sondas, sense e antisense, para os transcritos murinos de Ezh2, Suz12 e Eed. Os ensaios de Hibridização In Situ de RNA em cortes coronais de epitélio olfatório de camundongos de 4 e 21 dias de vida mostraram que Ezh2 é expresso na camada basal do epitélio, que corresponde região marcada para Ngn1, marcador células globosas. A expressão de Suz12 foi observada na camada basal e também na camada marcada por GAP43, marcador de neurônios imaturos, e por OMP, marcador de neurônios maduros. Não obtivemos marcação específica com a sonda para Eed. Para corroborar os resultados de Hibridização in situ de RNA analisamos os dados de sequenciamento de RNA de célula única de epitélio olfatório realizado por outro grupo de pesquisa. Essa análise mostrou que ao longo da diferenciação neuronal o número de células que expressam Ezh2, Suz12 e Eed diminui gradativamente, e que enquanto alguns neurônios olfatórios maduros expressam Suz12 e Eed, pouquíssimos desses neurônios expressam Ezh2 ou Ezh1. Os experimentos de imunofluorescência reforçam esses achados mostrando que neurônios olfatórios maduros expressam Suz12 e Eed, mas não expressam de Ezh2 em epitélio olfatório. Também em órgão vomeronasal observamos por imunofluorescência que os neurônios maduros expressam Suz12, mas não expressam de Ezh2. Esses resultados sugerem que uma vez que a enzima Ezh2 realizou a modificação covalente em H3K27 e silenciou regiões específicas do genoma da célula ao longo do processo de diferenciação do neurônio, no neurônio maduro a presença da enzima não seria mais necessária. Entretanto, as proteínas Suz12 e Eed se mantém em vários neurônios maduros, o que sugere que essas subunidades tenham no neurônio maduro um outro papel no núcleo celular que não apenas a ancoragem as subunidades catalíticas de PRC2 em regiões do genoma silenciadas.

Olfactory receptors (ORs) and vomeronasal receptors (VRs) are expressed by olfactory neurons (OSNs) and vomeronasal neurons (VSNs), respectively, and are responsible for the accurate detection of different molecules in the environment, which is crucial for animal survival. These receptors are members of the largest gene families in mammals, encoded by hundreds of alleles, and have monogenic and monollallelic expression in these neurons. OSNs have a peculiar nuclear architecture in which facultative heterochromatin is often concentrated around a central block of constitutive heterochromatin. VSNs seem to have the same organization as facultative heterochromatin. The Polycomb Repressor Complex 2 (PRC2) is responsible for the trimethylation of lysine 27 of histone 3 (H3K27me3), which characterizes facultative heterochromatin and leads to gene transcription silencing. PRC2 is formed by 3 main subunits, Ezh2/Ezh1, Suz12 and Eed, Ezh2 and Ezh1 are the catalytic subunits of the complex. This project aimed to the expression of transcripts, by RNA In Situ Hybridization, and proteins, by immunofluorescence, of Ezh2, Suz12, and Eed in mouse olfactory epithelium. We also characterized, by immunofluorescence, the expression of Ezh2 and Suz12 in mouse vomeronasal epithelium. To perform RNA In Situ Hybridization assays we constructed the vectors and synthesized the probes, sense and antisense, for the murine transcripts of Ezh2, Suz12, and Eed. RNA In Situ Hybridization assays in coronal sections of the olfactory epithelium of mice aged 4 and 21 days showed that Ezh2 is expressed in the basal layer of the epithelium, which corresponds to the region marked for Ngn1, a marker for globular cells. The expression of Suz12 is observed in the basal layer and also in the layer marked by GAP43, a marker of immature neurons, and by OMP, a marker of mature neurons. We did not obtain specific hybridization with the probe for Eed. To corroborate the RNA In Situ Hybridization results we analyzed the data of single cell RNA sequencing of olfactory epithelium performed by another research group. This analysis showed that throughout neuronal differentiation the number of cells expressing Ezh2, Suz12 and Eed gradually decreases, and that while some mature olfactory neurons express Suz12 and Eed, very few of these cells express Ezh2 or Ezh1. Immunofluorescence experiments reinforce these findings by showing that mature olfactory neurons express Suz12 and Eed, but do not express Ezh2. We also observed by immunofluorescence that in vomeronasal organ mature neurons express Suz12, but do not express Ezh2. These results suggest that once the Ezh2 enzyme performed the covalent modification in H3K27 and silenced 11 specific regions of the cell's genome throughout the process of neuron differentiation, in the mature neuron the presence of the enzyme would no longer be necessary. However, the Suz12 and Eed proteins remain in the nuclei of several mature neurons, which suggests that these subunits play a role in the mature neuron other than just anchoring the catalytic subunits of PRC2 in silenced regions of the genome.