Papel do miR-23b e miR-133a no controle de expressão de componentes da via TRAIL de apoptose em células de adenocarcinoma de pulmão (A549) e carcinoma renal (CaKi-2) e na sensibilização de células A549 ao TRAIL

Abstract

Introdução: A despeito dos avanços nas terapias antineoplásicas, desenvolvimento de resistência tumoral é um dos principais desafios no tratamento do câncer. A via de apoptose desencadeada pelo TRAIL é potencial alvo terapêutico. Entretanto, resistência ao TRAIL é um fenômeno apresentado pela maioria das células tumorais. A translocação dos receptores TRAIL para o núcleo está relacionada à resistência ao TRAIL. Além dos receptores TRAIL (DR4 e DR5), as proteínas Apaf-1, CUL3 (culina- 3), CLTA/CLTC (cadeias A e C da clatrina) e KPNA-1 (subunidade da importina) são componentes da via TRAIL. Apaf-1 é parte integrante do apoptossomo. CUL3 é ligase regulatória da caspase 8. Clatrina é implicada na translocação e KPNA-1 na internalização nuclear dos receptores TRAIL. Compreender os mecanismos de resistência ao TRAIL é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Evidências experimentais sugerem envolvimento do miR-23b e miR- 133a no controle da via TRAIL de apoptose. Objetivo: Em células humanas de adenocarcinoma de pulmão e carcinoma renal, verificar: papel do miR-23b e -133a na expressão de potenciais alvos da via TRAIL. Em células de adenocarcinoma de pulmão, verificar: a) papel do miR-23b e -133a na viabilidade celular e sensibilidade ao TRAIL; b) papel do miR-133a na compartimentalização celular dos receptores TRAIL. Métodos: cultura de células A549 (adenocarcinoma) e CaKi-2 (carcinoma renal) e seus respectivos controles (MRC-5 e HK2). PCR em tempo real (qRT-PCR) para avaliar expressão dos miRs de interesse e potenciais mRNAs-alvo. Expressão dos potenciais mRNAs-alvo após transfecção do inibidor do miR-23b e Mimic-133a. Em células A549: Western Blotting para verificação de expressão proteica de alvos encontrados para os miR-23b e -133a e da distribuição dos receptores TRAIL nos compartimentos nuclear e citoplasmático. Ensaio de viabilidade celular (MTT) após transfecção com inibidor do miR-23b e Mimic-133a com ou sem associação do estímulo TRAIL. Resultados e discussão: Ambas as linhagens (A549 e CaKi-2) foram resistentes ao TRAIL. Células A549: miR-23b foi superexpresso nas células A549 e sua inibição aumentou a expressão da Apaf-1 e CUL3, proteínas pró-apoptóticas. Células A549 não expressaram o miR-133a, e a transfecção do Mimic-133a diminuiu a expressão de CLTA e DR5. Ambas as estratégias (inibição do miR-23b e transfecção do Mimic- 133) sensibilizaram as células ao TRAIL. Os receptores DR4 e DR5 localizaram-se predominantemente no compartimento nuclear, o que pode representar um dos mecanismos de resistência ao TRAIL. Transfecção do Mimic-133a diminuiu a expressão da CLTA mas não alterou a distribuição dos receptores DR4 e DR5, sugerindo que a translocação dos receptores seja clatrina-independente. A combinação de Mimic-133a e TRAIL, por outro lado, promoveu maior concentração de ambos os receptores no compartimento nuclear em relação às células-controle, achado que necessitará investigação adicional. Células CaKi-2: a inibição do miR-23b não alterou a expressão dos mRNAs avaliados. Transfecção do Mimic-133a diminuiu a expressão da CLTA. Conclusão: Células A549: Ambos os miRs (-23b e -133a) têm participação na resistência das células tumorais ao TRAIL. O miR-23b controla a expressão de Apaf- 1 e CUL3, proteínas pró-apoptóticas, o que pode contribuir para a resistência ao TRAIL. Já a sensibilização ao TRAIL provocada pelo miR-133a deve ter seus mecanismos melhor estudados. Células CaKi-2: nenhum alvo foi encontrado para o miR-23b nas células CaKi-2, porém CLTA teve a expressão regulada pelo miR-133a. Embora necessitem de aprofundamento, nossos achados contribuem para maior entendimento da regulação da via TRAIL de apoptose e da resistência ao TRAIL.

Introduction: Despite recent therapeutic advances, lung adenocarcinoma and kidney carcinoma invariably become resistant to systemic treatment. TRAIL-induced apoptosis pathway is a potential therapeutic target, but the majority of tumors are TRAIL-resistant. TRAIL receptors translocation is associated to TRAIL resistance. Besides TRAIL receptors, DR4 and DR5, other potentially TRAIL-induced apoptosis pathway regulatory proteins are: Apaf-1 (part of apoptosome backbone), CUL3 (E3 ligase involved in caspase-8 activation), CLTA/CLTC (clathrin chains A and C, implicated in TRAIL receptors nuclear translocation) and KPNA-1 (importin subunit involved in TRAIL receptors nuclear internalization). Overcome TRAIL resistance is essential to therapeutic strategies development. Experimental evidence suggest that miR-23b and miR-133a are involved in TRAIL-induced apoptosis pathway control. Objective: to investigate miR-23b and -133a control on TRAIL-induced apoptosis pathway components expression in lung adenocarcinoma and kidney carcinoma cells. In lung adenocarcinoma cells: a) to verify miR-23b and -133a effects in cell viability and sensitization to TRAIL; b) miR-133a involvement in TRAIL receptors compartmentalization. Methods: A549 and CaKi-2 cell lines and their respective controls (MRC-5 and HK2) were used. Expression of miR-23b and miR-133a and DR4, DR5, Apaf-1, CUL3, CLTA/CLTC and KPNA-1 were estimated by RT-qPCR on both cell lineages. Transfection effects of miR-23b inhibitor and Mimic-133a on TRAIL-induced apoptosis pathway components expression. A549 cells: Western Blotting to verify TRAIL receptors compartmentalization after Mimic-133a transfection and TRAIL stimulus. MTT cell viability assay to evaluate TRAIL-induced cytotoxicity of miR-23b inhibition and Mimic-133a transfection. Results and discussion: Both cell lines were TRAIL resistant. A549 cells: miR-23b was superexpressed in A549 cells. miR-23b inhibition upregulated Apaf-1 and CUL3 expression. miR-133a was undetectable in A549 cells. Mimic-133a transfection downregulated CLTA and DR5 expression. Both strategies (miR-23b inhibition and Mimic-133a transfection) promoted TRAIL sensitization. DR4 and DR5 were predominantly located in nuclear compartment, a possible TRAIL resistance mechanism. Mimic-133a downregulated CLTA expression but did not alter receptors compartmentalization, suggesting that receptors translocation is a clathrinindependent mechanism. Mimic-133a and TRAIL associated stimulus, however, leaded to predominant nuclear TRAIL receptors localization in comparison to control cells. CaKi-2 cells: miR-23b inhibition did not change TRAIL apoptosis pathway components expression. miR-133a was undetectable by qRT-PCR. Mimic-133a transfection resulted in CLTA expression downregulation. Conclusion: In A549 cells: both miR-23b and -133a are involved in TRAIL tumoral cells resistance. Apaf-1 and CUL3 expression downregulation by miR-23b can contribute to TRAIL resistance. miR-133a role on TRAIL sensitization mechanisms must be further investigated. In CaKi-2 cells: except for CLTA, which expression was downregulated by Mimic-133a, the remaining evaluated targets are not regulated neither by miR-23b nor miR-133a. Although more research is needed to fully clarify miRs roles on TRAIL-induced apoptosis pathway in lung and kidney cancer, our findings deepen TRAIL resistance understanding.