Análise genômica de Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC provenientes do surto de um hospital de alta complexidade na cidade de São Paulo

Abstract

Introduction: Klebsiella pneumoniae carring blaKPC is endemic in Brasilian hospitals whrere its dissemination have been mostly mediated by isolates belonging to the clonal complex 258. Objective: To characterize the genome of K. pneumoniae isolates from an hospital outbreak and to evaluate the genetic deteminants related to the persistence of clonal profiles in a period of 5 years. Methods: Eleven KPC Klebsiella pneumoniae producers, isolated from an outbreak, followed by an endemicity, at a terciary hospital in the city of São Paulo were selected in the years 2000 to 2014. The genetic similarity among these isolates was obtained by PFGE and MLST analysis. The antimicrobial susceptibility profile was determined by agar dilution and broth microdilution. Antimicrobial resistance genes, virulence genes, MLST, plasmid profile, Single Nucleotide Polymorphims, porins and eflux pumps characterization was done by new generation sequencing. Hipermucoviscosity and biofilm production were evaluates by phenotypic tests. Conjugation protocols and S1 technique were utilized for plasmid analysis. The bacterial fitness was evaluated by the growth rate and the virulence by in vivo Galleria Mellonella experiments. Results: 5 PFGE profiles (A-E) and 4 STs were identified among these 11 isolates (mostly ST258). Gene conferring resistance to β-lactams, aminoglycosídes, fosfomycin, quinolones, phenicol, tetracycline, trimethoprim, sulphonamide and macrolides were detected in different proportions, and all isolates showed the genes blaKPC-2, blaSHV-11, fosA, oqxA and oqxB. All isolates showed the porins ompA, ompK37 and the eflux pump AcrAB-TolC intacts, the ompK35 was intact in 8/11 isolates, and the ompK36 revealed replacement in 4/11 isolates. The virulence genes clpK, rmpA, mrkD, fimH, kpn, entB, kfu, ybtS e traT were detected with variable prevalence. All isolates were able to produce biofim and the hipermucoviscosity phenotype was not found.

Introdução: A Klebsiella pneumoniae com blaKPC é endêmica em hospitais brasileiros e a sua disseminação tem sido mediada principalmente por isolados do complexo clonal 258. Objetivo: caracterizar o genoma de isolados de K. pneumoniae envolvidos em um surto hospitalar e avaliar os determinantes genéticos relacionados à persistência de um padrão clonal e às suas relações com demais padrões ao longo de cinco anos. Material e Métodos: Foram selecionados para o estudo 11 isolados de Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC, entre os anos de 2009 a 2014, todos associados a um surto seguido de endemia em hospital terciário de alta complexidade. A similaridade genética entre os isolados foi determinada pelas técnicas de PFGE e MLST. O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado pelas técnicas de diluição em ágar e microdiluição em caldo. A pesquisa dos genes de resistência, virulência, MLST, plasmídeos, Single Nucleotide Polymorphims, porinas e bomba de efluxo foi realizada pelo sequenciamento de nova geração,illumina. Para avaliar a presença de hipermucoviscosidade e formação de biofilme foram realizados testes fenotípicos in vitro. Também foi realizada a conjugação dos isolados e a técnica de S1 para avaliação dos plasmídeos. O fitness bacteriano foi avaliado pela mensuração da taxa de crescimento dos isolados e a virulência in vivo por meio de experimentos com Galleria Mellonella. Resultados: Foram encontrados 5 padrões distintos de PFGE (AE) e 4 diferentes STs (a maioria ST258) foram identificados entre os 11 isolados clínicos estudados. Altas taxas de resistência aos antimicrobianos foram observadas nos isolados. Foram encontrados genes que conferem resistência a β-lactâmicos, aminoglicosídeos, fosfomicina, quinolonas, fenicol, tetraciclina, trimetoprim, sufonamidas e macrolideos em diferentes proporções, porém todos os isolados apresentaram os genes de resistência blaKPC-2, blaSHV-11, fosA, oqxA e oqxB. Além22 disso, todos os isolados apresentaram as porinas ompA, ompK37 e a bomba de efuxo, AcrAB-TolC, integras, assim como a ompK35 que se manteve integra em 8/11 isolados, enquanto que a ompK36 foi encontrada substituição em 4/11 isolados. Os genes de virulência clpK, rmpA, mrkD, fimH, kpn, entB, kfu, ybtS e traT foram detectados e sua prevalência foi variada entre os isolados. O fenótipo de hipermucoviscosidade não foi encontrado, no entanto, todos foram capazes de formar biofilme. 10/11 isolados foram conjugativos e os plasmídeos identificados nos isolados pela técnica de S1 também foram encontrados nos isolados trasnsconjugantes e todos esses isolados abrigavam cópias do transposon TN4401a. Não foi observada diferença significativa no fitness bacteriano nos isolados avaliados e um isolado se mostrou altamente virulento por meio do modelo Galeria Mellonella. Conclusão: Esses resultados mostram que mesmo em ambientes endêmicos, o cenário epidemiológico pode mudar e clones virulentos podem emergir rapidamente, exigindo monitoramento constante.