Infecção por Giardia lamblia: identificação e papel das modificações pós-traducionais de proteínas na manutenção das junções intercelulares na barreira epitelial intestinal

Abstract

Giardia lamblia is a microaerophilic intestinal parasitic protozoan that inhabits the small intestine (duodenum and jejunum) of its hosts where they grow attached to the surface of intestinal epithelial cells on the luminal side. In this site the trophozoites multiply, triggering a diarrhea characteristic of giardiasis. In vitro studies show that diarrhea is due, among other things, to the loss of barrier function due to the rupture or relocation of intercellular junction proteins. Although these findings provide clues to the pathophysiological mechanisms of giardiasis, these studies were performed using culture of human colon enterocytes in atmospheric conditions. This work aimed to evaluate and compare the effect of infection of human duodenal and colon cells with Giardia trophozoites under normoxic and anaerobic conditions. In particular, to evaluate the integrity of the intestinal epithelial barrier and the profile of tight junction proteins and signaling pathways that regulate these processes, HuTu-80 human duodenal adenocarcinoma cells and Caco-2 human colorectal adenocarcinoma cells were used as models. Intestinal permeability of intestinal epithelial cultures, infected or not with trophozoites for 4 h, maintained in normoxia and anaerobiosis was assessed by measures of transepithelial electrical resistance (TEER) and paracellular flow of FITC-dextran (FD4). In addition, the effect of trophozoite infection on the expression profile of occlusive junction proteins and on the activation of PKCs, MLCK and ERK1 / 2 signaling pathways in the two intestinal cell lines was evaluated by Western blotting assays. Finally, the activation of signaling pathways that regulates intestinal permeability in infections by the parasite was evaluated by TEER and FD4 measurements with PKCs modules. Giardia's trophozoites promoted the dysfunction of the intestinal barrier of Caco-2 and HuTu-80 cells, by reducing the values of transepithelial electrical resistance and increasing the paracellular flow of FITC-dextran. In addition, the interaction resulted in the negative regulation of occlusive junction proteins ZO-2 and claudin-4 and pPKC α / β II and positive of ZO-1 and ocludine. Interestingly, the observed changes were more evident when the infection was maintained in anaerobiosis. Also, the rupture of the intestinal barrier, as well as the modulation of some junction proteins, were prevented with the use of a PKC activator. These results demonstrate an important role of PKC α / β II in the regulation of occlusive junctions of Caco-2 and HuTu-80 cells infected with G. lamblia trophozoites, being the first study to evaluate the effect of PKC modulators in the establishment of giardiasis.

A Giardia lamblia é um protozoário parasita intestinal microaerofílico que habita o intestino delgado (duodeno e jejuno) de seus hospedeiros onde crescem aderidos à superfície das células epitelial intestinais no lado luminal. Neste sítio os trofozoítos multiplicam-se desencadeando um quadro de diarreia característico da giardíase. Estudos in vitro mostram que a diarreia é decorrente, entre outras coisas, da perda de função de barreira devido à ruptura ou relocalização das proteínas de junção intercelulares. Apesar destes achados fornecerem pistas dos mecanismos patofisiológicos da giardíase estes estudos foram realizados usando-se cultura de enterócitos de cólon humano em condições atmosféricas. O presente estudo teve como objetivo avaliar e comparar o efeito da infecção de células de duodeno e de cólon humanos com trofozoítos de Giardia em condições de normóxia e anaerobiose. Particularmente, avaliar a integridade da barreira epitelial intestinal e o perfil de proteínas de junção oclusiva e das vias de sinalização que regulam estes processos, usando como modelo células de adenocarcinoma duodenal humano HuTu-80 e células de adenocarcinoma colorretal humano Caco-2 e HuTu-80. A permeabilidade intestinal de culturas epiteliais intestinais, infectadas ou não com trofozoítos por 4 h, mantidas em normóxia e anaerobiose foi avaliada por medidas de resistência elétrica transepitelial (TEER) e fluxo paracelular de FITC-dextran (FD4). Adicionalmente, o efeito da infecção por trofozoítos no perfil de expressão de proteínas de junção oclusiva e na ativação de vias de sinalização de PKCs, MLCK e ERK1/2 nas duas linhagens de célula intestinais foi avaliado por ensaios de Western blotting. Finalmente, a ativação de vias de sinalização que regulam a permeabilidade intestinal nas infecções pelo parasita foi avaliada por medidas de TEER e FD4 com moduladores de PKCs. Os trofozoítos de Giardia promoveram a disfunção da barreira intestinal de células Caco-2 e HuTu-80, observada através da redução dos valores de resistência elétrica transepitelial e do aumento do fluxo paracelular de FITC-dextran. Além disso, a interação resultou na regulação negativa das proteínas de junção oclusiva ZO-2 e claudina-4 e pPKC α/β II e positiva de ZO-1 e ocludina. Curiosamente as alterações observadas foram mais evidenciadas quando a infecção foi mantida em anaerobiose. Ainda, o tratamento de monocamadas infectadas com um ativador de PKC impediu a ruptura da barreira intestinal e a modulação de algumas proteínas de junção oclusiva. Os resultados aqui apresentados demonstram um papel importante da PKC α/β II na regulação das junções oclusivas de células Caco-2 e HuTu-80 infectadas com trofozoítos de G. lamblia, sendo o primeiro estudo a avaliar o efeito de moduladores de PKC no estabelecimento da giardíase.