Determinação da estrutura tridimensional de um inibidor de serinoproteases do tipo Kazal do mosquito aedes aegypti, vetor da dengue

Abstract

The mosquito Ae. aegypti is the main vector of arboviruses for humans in Brazil and it is responsible for outbreaks of dengue, chikungunya, yellow fever, and recently it has been involved in the high number of humans infected with zika virus. The hematophageal activity of Ae. aegypti allowed it to develop several strategies to control the hemostasis of vertebrate host’s. In 2010, our group expressed and characterized a serinepeptidase inhibitor belonging to Kazal family called rAaTI (Aedes aegypti Trypsin Inhibitor). The purified rAaTI was able to inhibit trypsin and affect coagulation time. With this data, the present work had as general objective the determination of three-dimensional structure of AaTI to understand its role in prolonging coagulation time. The rAaTI was purified in amount and an inhibitor preparation containing 20 mg/mL presenting high degree of homogeneity was used in crystallization experiments. The rAaTI crystallized in 100 mM sodium acetate, pH 5.5 containing 25% PEG 3350, 5% PEG 400 and 3% dioxane. Some crystals of rAaTI were dipped in sodium iodide solution with different concentrations (soaking) for 10 s to 1 min, and then they were analyzed (diffracted) on the MX2 line at the National Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Campinas. The three-dimensional structure of rAaTI was determined at high resolution of 1.4 Å. The unit cell of the crystal had an unusual low solvent content of approximately 22-23% (Torquato et al., 2017), accommodating two molecules of rAaTI. rAaTI has previously been described as inhibitor of serine protease, bovine trypsin (Ki = 0.15 nM) and human plasmin (Ki = 3.8 nM), and with anticoagulant activity, prolongating the coagulation time, including time of thrombin (TT) (Watanabe et al., 2010). In an attempt to clarify where rAaTI binds to the surface of thrombin, some experiments were performed using surface plasmon resonance (SPR) technology. Thrombin was immobilized on the surface of the CM5TM GE sensorchip. Different concentrations of rAaTI were applied to the surface containing immobilized thrombin and it was obtained a dissociation constant (KD) of 3.68 μM. Watanabe et al. showed a value of KD = 320 nM (Watanabe et al., 2011). The dissociation constant calculated by SPR is approximately ten times higher, which can be explained by partial blocking of thrombin exosites I and II during the enzyme immobilization procedure. The SPR experiments showed inhibition of the binding of rAaTI to thrombin in the presence of heparin, reinforcing the suggestion that AaTI can interacted to exosite II of thrombin.

O mosquito Ae. aegypti é o principal vetor de arboviroses para humanos, no Brasil e o responsável por surtos de dengue, chikungunya, febre amarela, e recentemente esteve envolvido no elevado numero de infectados com vírus zika. O hábito hematofágico do Ae. aegypti permitiu que desenvolve-se inúmeras estratégias de controle da hemostasia do seu hospedeiro vertebrado. Em 2010, o nosso grupo expressou e caracterizou um inibidor de serinopeptidase da família Kazal denominado de rAaTI (Aedes aegypti Trypsin Inhibitor). O rAaTI purificado foi capaz de inibir tripsina e afetar o tempo de coagulação. De posse destes dados, o presente trabalho teve como objetivo geral determinar a estrutura tridimensional do rAaTI para entender o seu papel no prolongamento do tempo de coagulação. O rAaTI foi purificado em quantidade e uma preparação contendo 20 mg/mL do inibidor com alto grau de homogeneidade foi utilizado em experimentos de cristalização. O rAaTI cristalizou em 100 mM acetato de sódio, pH 5,5 contendo 25% PEG 3350; 5% PEG 400 and 3% dioxana. Alguns cristais do inibidor foram mergulhados em soluções de iodeto de sódio com diferentes concetrações (soaking), por 10 s a 1 min, em seguida os mesmos foram analisados (difratados) na linha MX2 no laboratório Nacional de Luz Syncrotron (LNLS), Campinas. A estrutura tri-dimensional do rAaTI foi determinada em alta resolução de 1.4 Å. A célula unitária do cristal apresentou um volume de solvente incomum baixo de aproximadamente 22-23% (Torquato et al., 2017), acomodando duas moléculas do rAaTI. O rAaTI foi anteriormente descrito como inibidor de serinoprotease, tripsina bovina ( Ki = 0,15 nM) e plasmina humana (Ki = 3,8 nM ), e com atividade anticoagulante, promovendo o prolongamento do tempo de coagulação, incluindo o teste de tempo de trombina (TT) (Watanabe et al., 2010). Na tentativa de esclarecer onde o rAaTI se liga na superfície da trombina, alguns experimentos foram realizados usando a tecnologia “ SPR “ (do inglês – surface plasmon resonance). A trombina foi imobilizada sobre a superfície do sensor-chip CM5TM GE. Diferentes concentrações de rAaTI foram aplicadas a superfície com a trombina imobilizada e uma constante de dissociação (KD) de 3,68 μM foi obtida. Watanabe e colaboradores mostraram um valor de KD = 320 nM (Watanabe et al., 2011). A constante de dissociação calculada por SPR é aproximadamente dez vezes maior, que pode ser explicado pelo bloqueado parcial dos exosítios I e II da trombina durante o procedimento de imobilização da enzima. Os experimentos de SPR mostraram inibição da ligação de rAaTI a trombina na presença da heparina, reforçando a sugestão de que o AaTI pode se ligar ao exosítio II da trombina.