Tese de doutorado
Expressão gênica de células da córnea submetidas à infecção por acanthamoeba Spp
Fecha
2018-06-28Autor
Sant'Ana, Viviane Peracini [UNIFESP]
Institución
Resumen
Objective: The present research project proposes: 1) to analyze the proteolytic
degradation of the main substrates present in the cornea (collagen, fibronectin,
laminin and tubulin) with the Acanthamoeba exoproteome; 2) to analyze the
cytotoxicity of the Acanthamoeba exoproteome of in HUVEC cells in 11 clinical
isolates and which its main mechanism of induction of cell death; 3) to identify by
benzamidinesepharose
purification of the serine protease class; 4) to characterize
the Acanthamoeba exoproteome at different pHs and temperatures; 5) to analyze the
susceptibility of the Acanthamoeba exoproteome with diamidines and enzymatic
inhibitors. Methods: Primary cultures of trophozoites were obtained by corneal
scraping of patients with Acanthamoeba spp. Analysis of the Acanthamoeba
exoproteome was performed by zymography (SDSPAGEgelatin),
0.01% gelatin
polyacrylamide gel was prepared according to the subunits of its substrates:
Fibronectin, Laminin and Tubulin. The HUVECs were cultured in a humid oven at 37
° C to 5% CO2 in RPMI culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum.
The proteolysis assay of type I collagen was carried out by the hydrolysis of type I
collagen, at a concentration of 0.4 mg / ml, previously dialyzed in specific buffer (50
mM TrisHCl,
pH 7.5, 150 mM NaCl). In the analysis of the characterization of the
Acanthamoeba exoproteome in different buffers of pHs and at different temperatures
where each clinical isolate was removed from the gel and placed at different pHs
(pHs 2.0 12.0).
The diamidines used were 0.1% Brolene and 0.1% Désomédine,
also 0.1 mM PMSF and 215 μM Trasylol enzyme inhibitors were used. Results: The
proteolytic profile of Acanthamoeba exoproteome is associated with severity of
infection observed in the patient. The degradation of type I collagen by the
Acanthamoeba exoproteome the laboratory results corroborate with the clinical
aspect observed in patients with moderate and severe amoebic keratitis. In the
cytotoxicity assay, in vitro results from the Acanthamoeba exoproteome with HUVEC
suggest the contact independence of trophozoite to induce cell death by apoptosis.
We were able to demonstrate by in vitro protein assays, whose results prospect the
mechanisms of gene expression in corneal cells, the functional aspects of different
amoebic exoproteomes associated with healing and regeneration, whose processes
are mainly mediated via cellular signaling in the host. Affinity chromatography demonstrated the prevalence of proteolytic enzymes of the class of serine proteases
contained in the protozoan exoproteome. In the proteolysis assays of the
Acanthamoeba exoproteome at different pH conditions and at different temperatures,
it showed strong resistance to different pH and temperature conditions where they
were evaluated in the period of 4 and 16 hours, where the optimum temperature was
35 ° C and 37 ° C in pH 7.0 appropriate conditions for the pathophysiology of
amoebic keratitis. In the experiment with the diamidines, we noticed that unlike
propamidine, hexamidine was not able to totally inhibit the enzymatic activity of the
exoproteome. Conclusions: Exoproteome produced by Acanthamoeba spp
trophozoites consists of a large diversity of enzymes, with emphasis on the enzymes
belonging to the class of serine proteases. The enzymatic activity contained in the
different amoebic exoproteomes suggests an important influence on the mechanisms
of gene expression, with emphasis on the production of extracellular matrix
compounds by corneal cells. The exoproteomes may present a pattern of physical
and chemical resistance associated with enzymatic activity. The enzymatic
constituents of different amoebic exoproteomes express proteins capable of
degrading the main type I collagen and glycoproteins present in the cornea, besides
inducing cell death by contact independent apoptosis. Laboratory isolation followed
by amoebic exoproteome analysis demonstrates the importance of translational
research associated with the present study, since the enzymatic constituents
secreted by the protozoan can induce cell death and interferes in the synthesis of
extracellular matrix compounds linked to the healing and regeneration processes
tissue. Consequently, mechanisms associated with gene expression in epithelial cells
and keratocytes can be inactivated, prospecting worsening in the clinical pattern of
the patient. Objetivo: O presente projeto de pesquisa se propôs: 1) Analisar a degradação
proteolítica dos principais substratos presentes na córnea (colágeno, fibronectina,
laminin e tubulina) com o exoproteoma de Acanthamoeba spp; 2) Analisar a
citotoxicidade do exoproteoma de Acanthamoeba spp em células HUVEC em 11
isolados clínicos assim como identificar seu principal mecanismo de indução de
morte celular; 3) Identificar o exoproteoma Acanthamoeba spp através da purificação
com benzamidinesepharose
da classe de serino protease; 4) Caracterizar o
exoproteoma de Acanthamoeba spp em diferentes pHs e temperaturas; 5) Analisar a
susceptibilidade do exoproteoma de Acanthamoeba spp às diamidinas aos inibidores
enzimáticos. Métodos: Foram obtidas culturas primárias de trofozoítos por meio do
raspado de córnea de pacientes com ceratite por Acanthamoeba spp. A análise do
exoproteoma de Acanthamoeba spp foi realizada por método de zimografia (SDSPAGEgelatina),
o gel de poliacrilamida com 0,01 % de gelatina foi preparado de
acordo com as subunidades de seus substratos: Fibronectina, Laminina e Tubulina.
As células HUVECs foram cultivadas em estufa úmida na temperatura de 37°C a 5%
CO2, no meio de cultura RPMI com suplemento de 10% de soro fetal bovino. O
ensaio de proteólise da molécula de colágeno tipo I, foi obtido pela hidrólise do
colágeno tipo I, na concentração de uso de 0.4 mg/ ml, previamente dialisado em
tampão específico (TrisHCl
50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM). Para a análise da
caracterização do exoproteoma de Acanthamoeba spp em diferentes tampões de
pHs e em diferentes temperaturas cada isolado clínico foi retirado do gel e colocado
em diferentes pHs (pHs 2.0 – 12.0). As diamidinas utilizadas foram Brolene 0,1% e
Désomédine 0,1%. Também foram utilizados inibidores enzimáticos PMSF 0,1 M e
Trasylol 215 μM. Resultados: O perfil proteolítico do exoproteoma de
Acanthamoeba spp está associado com gravidade da infecção observada no
paciente. A degradação de colágeno tipo I pelo exoproteoma de Acanthamoeba spp
os resultados laboratoriais corroboram com o aspecto clínico observado nos
pacientes portadores de ceratite amebiana moderada e grave. No ensaio de
citotoxicidade, o presente estudo (in vitro do exoproteoma de Acanthamoeba spp
com HUVEC) mostrou a independência de contato do trofozoíto na indução da morte
celular por apoptose. Os ensaios protéicos in vitro, cujos resultados prospectam aos mecanismos de expressão gênica em linhagens celulares da córnea, demonstraram
o aspecto funcional dos diferentes exoproteomas amebianos associado à
cicatrização e regeneração, cujos processos são mediados principalmente via
sinalização celular no hospedeiro. A cromatografia de afinidade demonstrou a
prevalência de enzimas proteolíticas da classe das serinoproteases
contidas no
exoproteoma do protozoário. Nos ensaios de proteólise do exoproteoma de
Acanthamoeba spp em diferentes condições de pH e diferentes temperaturas
observouse
forte resistência do composto proteico a diferentes condições de pHs e
temperaturas onde foram avaliados no período de 4 e 16 horas, onde a temperatura
ótima foi de 35°C e 37°C no pH 7.0 condições apropriadas para a patofisiologia da
ceratite amebiana. Quanto ao experimento com as diamidinas, verificouse,
ao
contrário da propamidina, a hexamidina não foi capaz de inibir totalmente a atividade
enzimática do exoproteoma. Conclusões: O presente estudo indica que o
exoproteoma produzido por trofozoítos de Acanthamoeba spp consiste de grande
diversidade de enzimas, com ênfase às enzimas pertencentes à classe das serinoproteases.
A atividade enzimática contida nos diferentes exoproteomas amebianos
sugere influência relevante sobre os mecanismos de expressão gênica, com ênfase
à produção de compostos de matriz extracelular pelas células da córnea. Os
exoproteomas apresentou padrão de resistência física e química associado à
atividade enzimática. Os constituintes enzimáticos de diferentes exoproteomas
amebianos expressam proteínas capazes de degradar as principais glicoproteínas e
colágeno tipo I presentes na córnea, além de induzir a morte celular por apoptose,
independente de contato direto do trofozoíto. O isolamento laboratorial seguido da
análise do exoproteoma amebiano demonstra a importância da pesquisa
translacional associada ao presente estudo, uma vez que os constituintes
enzimáticos secretados pelo protozoário podem induzir à morte celular e interferir na
síntese de compostos de matriz extracelular vinculados aos processos de
cicatrização e regeneração tecidual. Consequentemente, mecanismos associados à
expressão gênica em células epiteliais e ceratócitos podem ser inativados, prospectando piora no quadro clínico do paciente.