Análise de genes diferencialmente expressos (DEGs) e de regiões da cromatina diferencialmente acessíveis (DARs) em rins humanos com nefropatia diabética

Abstract

Introdução: Em doenças complexas e dependentes de interação com o ambiente, como a nefropatia diabética, o controle epigenético da expressão gênica pode mediar a resposta do organismo aos fatores ambientais e contribuir para a suscetibilidade às complicações decorrentes da doença. Uma das possíveis abordagens para o estudo de mecanismos epigenéticos é a observação do funcionamento da cromatina e a elucidação de regiões acessíveis à maquinaria transcricional. Além de por meio da cromatina, os mecanismos epigenéticos podem ser observados pelo padrão de expressão gênica. Pode-se observar no campo da epigenética a possibilidade de ampliar a compreensão sobre a fisiopatologia da nefropatia diabética, bem como encontrar novos alvos terapêuticos, visto que, embora haja uma redução na velocidade de progressão da doença com o uso dos fármacos disponíveis, ainda há espaço para melhores tratamentos. Objetivo: Encontrar regiões diferencialmente acessíveis da cromatina – DARs – e genes diferencialmente expressos – DEGs – em amostras de rins humanos controle e com nefropatia diabética, além de explorar a relevância funcional dos achados in silico, observar redes de co-expressão e identificar enriquecimento de fatores de transcrição. Métodos: Foram coletadas porções saudáveis de rins derivadas de nefrectomias por tumor tanto de pacientes com nefropatia diabética quanto controle. Os tecidos foram sequenciados quanto ao RNA (RNA-seq) e às regiões acessíveis da cromatina (ATAC- seq). Os grupos foram comparados e foram identificados DARs e DEGs, além da realização da análise de redes de co-expressão (WGCNA) e de enriquecimento de fatores de transcrição. Resultados: Após a comparação de pacientes controle (n = 22) e pacientes com nefropatia diabética (n = 26), foram encontradas 4.861 DARs (101 supra-reguladas e 4.760 infra-reguladas), que foram posteriormente associadas aos genes mais próximos (4.773 genes). Foram também encontrados 1.339 DEGs (1.156 supra-regulados e 183 infra-regulados). A análise de relevância biológica dos genes encontrados concomitantemente nas duas análises (n = 301 genes) revelou processos biológicos de ativação de células T como os de maior enriquecimento. A análise de redes identificou 17 módulos de genes co-expressos, sendo que dois módulos obtiveram melhores resultados e revelaram perfis de processos biológicos relacionados a processos imunológicos e de diferenciação de tecido renal. A análise de fatores de transcrição das DARs encontradas revelou o enriquecimento principal dos seguintes fatores: fator de transcrição HNF4G, específico de células do túbulo proximal; fator HNF1-β, relevante no desenvolvimento e diferenciação do tecido renal, além de envolvimento em diabetes monogênica; e fator NR2F2, importante na proliferação do mesênquima metanéfrico. Conclusão: Foram observadas diferenças epigenéticas entre o grupo controle e o grupo nefropatia diabética, sendo que houve destaque para processos imunológicos tanto na análise de DARs e DEGs quanto na análise de redes. Os genes e regiões devem ser mais profundamente estudados e possuem o potencial de, futuramente, funcionarem como alvos farmacológicos para a doença. Este estudo contribui para o avanço no entendimento do funcionamento do tecido renal quanto à epigenética, além de aprofundar especificamente a compreensão da fisiopatologia da nefropatia diabética.

Introduction: For complex and environment-dependent diseases, as diabetic nephropathy, epigenetic control of gene expression may influence the organism response to environmental factors and contribute to susceptibility to complications. One possible approach to study epigenetic mechanisms is to observe chromatin function and those regions accessible to transcriptional machinery. Other than chromatin, mechanisms can be observed by gene expression pattern. The epigenetic field allows knowledge expansion regarding diabetic nephropathy, as well as exploration of possible new drug targets. Although available medical treatments slow the progression of disease, there is still a need for better approaches. Objective: Find differentially accessible regions – DARs – and differentially expressed genes – DEGs – between human kidney control samples and diabetic nephropathy samples, as well as explore biological relevance of findings in silico, observe co- expression networks and identify transcription factor enrichment. Methods: We collected healthy portions of kidneys from nephrectomies due to tumor from both control patients and diabetic nephropathy patients. Tissues were RNA sequenced (RNA-seq) and accessible chromatin sequenced (ATAC-seq). Groups were compared regarding DARs, DEGs, gene co-expression network analysis (WGCNA) and transcription factor (TF) enrichment. Results: After comparing control patients (n = 22) and diabetic nephropathy patients (n = 26), we were able to identify 4,861 DARs (101 upregulated and 4,760 downregulated regions), which were associated with the closest genes (4,773 genes). Besides DARs, we also found 1,339 DEGs (1,156 upregulated and 183 downregulated genes). Considering the two aforementioned analyses, there were 301 overlapping genes. After biological relevance analysis, we identified enrichment for T cell activation and related biological processes. Network analysis showed 17 modules of co-expressed genes and two were selected for in-depth analysis. They revealed enrichment for immune processes and kidney tissue differentiation. TF analysis of DARs revealed enrichment of the following: HNF4G, a TF known to be enriched in proximal tubule cells; TF HNF1-β, known as a relevant gene for development and kidney tissue differentiation, as well as monogenic diabetic disease; and TF NR2F2, known to be involved in metanephric mesenchyme proliferation. Conclusion: We observed epigenetic differences between control and diabetic nephropathy groups. The findings highlight the involvement of immune processes for DAR and DEG analysis, as well as for the network analysis. Genes and regions found in our study should be more deeply investigated and may be potential targets for disease treatment. Our study contributes to comprehension of diabetic kidney disease molecular details, as well as its physiopathology.