Análise de aneuploidia em Trypanosoma cruzi pela técnica de FISH (“Fluorescence In Situ Hybridization”)

Abstract

O protozoário parasita Trypanosoma cruzi possui características marcantes de variabilidade genética que podem desempenhar um papel importante na adaptação do parasita às mudanças ambientais durante seu ciclo de vida, incluindo resistência às drogas em hospedeiros mamíferos. Embora o T. cruzi tenha sido considerado um organismo diploide, análises por hibridização genômica comparativa e sequenciamento genômico de nova geração mostraram a presença de aneuploidia segmentar (perda ou ganho de um fragmento cromossômico) e aneuploidia cromossômica (cromossomos com diferentes somia) em uma mesma população de parasitas. A aneuploidia pode constituir-se em uma fonte de variabilidade genética em T. cruzi, organismo que se reproduz assexuadamente e apresenta evolução predominantemente clonal. Nós investigamos o nível de aneuploidia em T. cruzi por hibridização fluorescente in situ (FISH), que permite a avaliação da ploidia no nível de célula única. Nós selecionamos os genes H49 e JL8 como marcadores cromossomo-específicos, presentes em cópia única no cromossomo TcChr39 do clone CL Brener. Os genes H49 e JL8 codificam antígenos repetitivos portadores de repetições de aminoácidos arranjadas em tandem. As regiões centrais dos genes H49 e JL8 compreendem grande número de repetições em tandem que podem atuar como alvo adequado para hibridação de DNA. A ploidia foi estimada em aproximadamente 600 células marcadas para cada sonda em triplicata por 2 observadores independentes. Células com duplo flagelo e/ou dois cinetoplastos (células mitóticas) foram excluídas da análise. Os níveis de ploidia também foram confirmados por microscopia confocal e em parasitas coletados na fase G1 do ciclo celular após sincronização com hidroxiureia. Variações no número de cópias dos genes H49 e JL8 foram identificadas em uma mesma população de parasitas produzindo subpopulações de células com diferentes ploidia. A distribuição do número de cópias do gene H49 por célula foi a seguinte: 26,3% das células têm uma cópia do gene H49 (haploide), 41,1% têm duas cópias (diploide) e 16,7% têm três cópias (triploide). Em relação ao gene JL8, 39,2% das células possuem apenas uma cópia do gene JL8, 35,1% possuem duas cópias e 10,6% possuem três cópias. A origem de células haploides para os genes H49 ou JL8 poderia ser explicada pela deleção do gene por “crossing over” desigual entre cromátides irmãs na mitose, resultando em aneuploidia segmentar. A célula triploide poderia ser resultante de erro na segregação cromossômica na mitose por não disjunção do cromossomo TcChr39. A ocorrência de células haploides para os genes H49 e JL8 também pode ser explicada pela falha das cromátides TcChr39 em se separar durante e após a mitose. As variações do número de cópias dos genes H49 e JL8 entre as células de uma mesma população podem produzir mosaicismo cromossômico e heterogeneidade intra-cepa em T. cruzi. Para testar as hipóteses acima, nós estamos trabalhando com FISH de duas cores no cromossomo TcCh39 usando as sondas H49 e JL8.

The protozoan parasite Trypanosoma cruzi has marked traits of genetic variability that may play an important role in the parasite's adaptation to environmental changes during its life cycle and, including drug resistance in mammalian hosts. Although T. cruzi has been considered a diploid organism, analyses by comparative genomic hybridization and next generation genomic sequencing have shown the presence of segmental aneuploidy (loss or gain of a chromosomal fragment) and chromosomal aneuploidy (chromosomes with different somy) in the strains and clones of this parasite. Aneuploidy may constitute a source of genetic variability in T. cruzi, an organism that reproduces asexually and presents predominantly clonal evolution. We investigated the level of aneuploidy in T. cruzi by means of fluorescent in situ hybridization (FISH), which allows the assessment of ploidy at the single cell level. We selected the genes H49 and JL8 as chromosome-specific markers, they are single copy genes located in the chromosome TcChr39 of clone CL Brener. The H49 and JL8 genes encode repetitive antigens carrying tandemly arranged amino acid repeats. The central regions of the H49 and JL8 genes comprise a large array of tandem repeats that may be suitable targets for DNA hybridization. We estimated ploidy on an average of 600 cells labeled for each probe in triplicate samples by 2 independent observers. Cells with a double flagellum and/or two kinetoplasts (mitotic cells) were excluded from the analysis. Ploidy levels were also confirmed by confocal microscopy and with parasites collected in the G1 phase of the cell cycle after synchronization with hydroxyurea. Variations in the number of copies of the H49 and JL8 genes were identified in the same population of parasites producing subpopulations of cells with different ploidy. The distribution of the number of copies of the H49 gene per cell was as follows: 26.3% of the cells have one copy of the H49 gene (haploid), 41.1% have two copies (diploid), and 16.7% have three copies (triploid). Regarding the JL8 gene, 39.2% of the cells have only one copy of the JL8 gene, 35.1% have two copies and 10.6% have three copies. The origin of haploid cells for the H49 or JL8 genes could be explained by deletion of the gene by unequal crossing over between mitotic sister chromatids, resulting in segmental aneuploidy. The triploid cell could be the result of an error in chromosomal segregation in mitosis due to non-disjunction of the chromosome TcChr39. The occurrence of haploid cells for H49 and JL8 genes could be also explained by the failure of TcChr39 chromatids to separate during and after mitosis. Variation in the number of copies of H49 and JL8 genes among cells of the same population can produce chromosomal mosaicism and intra-strain heterogeneity in T. cruzi. To test the hypotheses above we are carrying out dual-color FISH on the chromosome TcCh39 using the H49 and JL8 probes.