Dissertação de mestrado
Síntese de peptídeos em fase sólida: reavaliação do uso do ácido trifluorometanosulfônico na etapa de clivagem peptídica da resina
Date
2017-04-28Author
Pinto, Marcelo Rodrigo Silva [UNIFESP]
Institutions
Abstract
The main objective of the present work was to reavaluate the strategy of the use of trifluoromethanesulfonic acid (TFMSA) in the step of final cleavage of peptides from the support resin. The main reason for investing in this topic is due to the great difficulty of operationalization that occurs with the more conventional method used in Boc (tert-butyloxycarbonyl) chemistry, which is cleavage in anhydrous HF. Because it is toxic, extremely corrosive, it requires imported equipment made with special Teflon, difficult to handle and that currently in Brazil, is unviable to be used due to the inexistence of a chemical company that produces this acid. And the option for importation (in special stainless steel cylinders) has so far not been feasible. In this context, the study of this alternative method of cleavage with the strong acid TFMSA had already been preliminarily initiated in our laboratory some years ago and we had observed that, in addition to evaluating the efficiency of the cleavage method in terms of the purity of the removed material, it was fundamental to quantitatively determine this step, ideally with the integral removal of chains from the resin matrix and also the protecting groups of the reactive amino acid side chains. In this way, we decided to investigate deeply the TFMSA´s cleavage method. Briefly, we have observed that a solution composed of TFMSA: TFA: DMS: o-cresol, in the ratio 20: 70: 5: 5 (v / v), appeared to be suitable for the integral removal of peptide chains, even those containing hydrophobic amino acids linked to the resin and which we have shown to be difficult to cleave due to the high stability of the covalent bond between them and the resin backbone in an acid medium. The aforementioned protocol with 20% TFMSA in solution was more efficient when compared to the literature solutions that employ this acid in amounts always around 10%. On the other hand, kinetic studies of cleavage with TFMSA Summary 18 also showed that at 8 ° C (in cold room), the time required for integral peptide cleavage was 6 h. Preliminary studies of the synthesis efficiency between the traditional Boc (tert-butyloxycarbonyl) chemistry and the Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) alternative indicated the influence of the peptide sequence in this comparison between these two synthetic techniques. The use of this mixture containing 20% (v / v) TFMSA was also fortunately viable (as is in the anhydrous HF) for use in cleavage the procedure of peptide sequences bearing amino acid – type spin probes such as the known Toac (acid 2, 2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl-4-amino-4-carboxylic acid). No irreversible degradation occurred with this type of nitroxide-group paramagnetic compounds during this strongly acid treatment. In addition, important investigation of the lability degree of some protecting groups of amino acid side chains of peptide sequences has been developed and indicated for example that the Nα-Fmoc group is surprisingly removed in this acidic cleavage medium with TFMSA. The Arg´s p-toluenesulfonyl (Tos) protecting was also shown to be susceptible to total removal in this acid medium, unlike the formyl group (For) of Trp, which remained stable against the deprotection reaction. In this case, we successfully tested cleavage of this indolic ring protecting group by pretreatment of the peptidyl resin in 4-methylpiperidine followed by the cleavage in the standard condition of 20% TFMSA. The last and most problematic item herein examined involved a more careful study of the reported cyclization reaction occurring in the side chain of Asp residue, resulting in a a succinimidic-type cyclic side-product formation (elimination of a water molecule) with – 18 Da lower molecular weight than the expected for the peptide of interest. Initial studies of this item, performed with the hypertensive peptide AII and its Gly8-AII derivative indicated that in the standard cleavage mixture used (20% TFMSA for 6 h at 8 °C); the percentage of Summary 19 the analogue containing the Asp-succinimide residue was about 14%, in comparison with respective native peptides. Thus, among the several items that will require continuity, this is one of the most extensive, with the possibility of alterations of several parameters during the acid cleavage stage, including not only the modification in the composition of the acid mixture but also the temperature and time of this hydrolytic reaction. Nevertheless, the present study based on experiments with several types of peptide sequences, indicated the feasibility of using the TFMSA: TFA: DMS: o-cresol solution in the ratio of 20: 70: 5: 5 (v / v) to 8 ° C in 6 h as a protocol to be used in Boc-SPFS chemistry, replacing the traditional cleavage process in anhydrous HF. The importance of this fact should be emphasized, since the TFMSA cleavage method is much simpler, practical and with more potential for application of greater scale of synthesis due to the possibility of handling bigger glass flasks and bottles in comparison with small Teflon reaction flasks used in the anhydrous HF peptide cleavage procedure. O presente trabalho teve como objetivo principal, se fazer, no método da síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS), uma reavaliação da estratégia do uso do ácido trifluorometanosulfônico (TFMSA) na etapa da clivagem final de peptídeos da resina de suporte. A principal razão para se investir neste tema se deve à grande dificuldade de operacionalização que ocorre com o método mais convencional usado na química Boc (tert-butiloxicarbonila) que é o da clivagem em HF anidro. Por ser tóxico, extremamente corrosivo, necessita de equipamento importado feita com teflon especial, de difícil manuseio e que atualmente no Brasil, está inviável de ser utilizado em função da inexistência de uma empresa química que produza este ácido. E a opção pela importação (em cilindros especiais de aço inoxidável) se mostrou até o momento impraticável. Neste contexto, o estudo deste método alternativo de clivagem com o ácido forte TFMSA já havia sido iniciado preliminarmente em nosso laboratório há alguns anos e havíamos observado que, além de se avaliar a eficiência do método da clivagem em termos da pureza do material clivado, era fundamental a determinação quantitativa desta etapa idealmente com a remoção integral de todas as cadeias presas da matriz da resina e dos grupos protetores das cadeias laterais reativas de aminoácidos. Resolvemos deste modo, investigar com mais detalhes, a clivagem em TMFSA. Sucintamente, observamos que uma mistura composta por TFMSA:TFA:DMS:o-cresol, na proporção 20:70:5:5 (v/v), pareceu ser apropriada para a remoção integral de cadeias peptídicas, mesmo as que contêm aminoácido hidrofóbicos presos à resina e que havíamos demonstrado serem de difícil clivagem em função da alta estabilidade da ligação covalente entre os mesmos e a resina em meio ácido. O protocolo acima mencionado com 20% de Resumo 15 TFMSA em solução se mostrou mais eficiente se comparado às soluções da literatura que empregam este ácido em quantidades sempre ao redor de 10%. Por outro lado, estudos cinéticos de clivagem com TFMSA mostraram também que a 8ºC (em câmara fria), o tempo necessário para a clivagem peptídica integral era de 6 h. Estudos preliminares da eficácia de síntese entre a tradicional química Boc (terc-butiloxicarbonila) e a alternativa Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonila), indicaram a influência da sequência peptídica nesta comparação entre estas duas técnicas de síntese. O uso da mistura mencionada contendo 20% (v/v) de TFMSA felizmente também se mostrou viável para uso (como no caso com HF anidro), nos casos de clivagens de peptídeos contendo compostos marcadores de spin, do tipo aminoácido como o conhecido composto Toac (ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil-4-amino-4-carboxílico). Não se observou degradação irreversível com estes tipos de compostos paramagnéticos contendo grupamentos nitróxidos durante o tratamento neste meio ácido forte. Além disto, a importante investigação do grau de labilidade de alguns grupos protetores de cadeias laterais de aminoácidos de sequências peptídicas foi desenvolvida e indicou, por exemplo, que o grupo Nα- Fmoc é removido surpreendentemente neste meio ácido de clivagem com TFMSA. O grupo p-toluenosulfonila (Tos), protetor da Arg, se mostrou também susceptível à remoção total neste meio ácido, ao contrário do grupo formila (For) do Trp, que se manteve estável frente à reação de desproteção. Nesse caso, testamos alternativamente com sucesso, a clivagem desse grupo protetor de anel indólico, via tratamento prévio da peptidil-resina em 4-metilpiperidina, seguida da clivagem na condição padrão de 20% TFMSA. O último e mais problemático item examinado envolveu um estudo mais criterioso da reportada ocorrência de reação de uma ciclização envolvendo a cadeia lateral da Asp nesta Resumo 16 condição ácida resultando num anel succinimídico, o que leva a um contaminante com peso molecular 18 Da menor (eliminação de uma molécula de água) que a massa molecular esperada para o peptídeo de interesse. Estudos iniciais deste item, efetuados com o peptídeo hipertensor AII e seu derivado Gly8-AII, indicaram que na mistura padrão de clivagem empregada (de 20% TFMSA por 6 h a 8ºC), a porcentagem encontrada deste subproduto contendo o resíduo de Asp-succinimida foi de cerca de 14% em comparação com os peptídeos nativos. Deste modo, dentre os diversos itens que necessitarão de continuidade, este é um dos mais amplos, com possibilidade de alterações de inúmeros parâmetros durante a etapa de clivagem ácida, incluindo-se alteração não somente da composição da mistura ácida, mas também da temperatura e do tempo desta etapa hidrolítica. De qualquer modo, o presente estudo, baseado em experimentos com diversos tipos de sequências peptídicas indicou a viabilidade do uso da mistura TFMSA:TFA:DMS:o-cresol na proporção 20:70:5:5 (v/v), a 8ºC em 6 h, como protocolo a ser empregado na química Boc-SPFS, em substituição ao processo de clivagem tradicional em HF anidro. A importância deste fato deve ser enfatizada, pois o método de clivagem com TFMSA é bem mais simples, prático e comparativamente com maior potencial para síntese em escala bem maior, devido à possibilidade de uso de frascos e balões de volumes bem maiores, se comparados aos frascos de teflon de tamanho restrito utilizados no protocolo de clivagem peptídica em HF anidro.