Formação de vacúolos quiméricos com leishmania amazonensis e trypanosoma cruzi e participação da subunidade d2 da ATPase vacuolar na biogênese dos vacúolos parasitóforos de leishmania amazonensis

Abstract

De modo a investigar a influência de um vacúolo personalizado por um primeiro patógeno na sobrevida e diferenciação de um segundo, desenvolvemos um modelo in vitro de coinfecção intracelular envolvendo L. (L.) amazonensis e T. cruzi em macrófagos RAW 264.7. Foi possível demonstrar a formação de vacúolos quiméricos contendo os dois parasitas, pelo registro videomicrográfico da transferência, diferenciação e multiplicação de T. cruzi no interior do VP de L. (L.) amazonensis. Considerando que o VP recipiente de L. (L.) amazonensis é um compartimento acidificado pela ação das v-ATPases, desenvolvemos um modelo de macrófago RAW 264.7 silenciado para a subunidade d2 da v-ATPase (ATP6V0d2), de modo a verificar se a acidificação vacuolar é decisiva para a diferenciação deste parasita e também de T. cruzi no modelo de dupla infecção. Demonstramos que o tamanho dos VPs de L. (L.) amazonensis foi drasticamente reduzido nos macrófagos silenciados para esta subunidade das V-ATPases, não sendo observados os vacúolos quiméricos após a coinfecção com o T. cruzi. Contudo, na infecção nos macrófagos nocauteados até a interferência da ATP6V0d2 aumentou a multiplicação dos amastigotas no VP e induziu a formação de vacúolos tight-fitting. O silenciamento desta subunidade não interferiu na acidificação de fagolisossomos, mas provocou a inibição do processamento de precursores da forma madura da catepsina D, a inibição da atividade enzimática da lipase ácida lisossomal e diminuição da concentração celular de colesterol. Os resultados obtidos demonstram que o VP característico da L. (L.) amazonensis dá suporte à diferenciação de o T. cruzi, e que o crescimento típico dos VPs desenvolvidos por esta espécie de Leishmania é dependente da subunidade V0d2 das v-ATPases.

During the process of cell invasion by different evolutionary forms of the protozoa Leishmania (Leishmania) amazonensis and Trypanosoma cruzi, the generation of a parasitophorous vacuole (PV), harboring the parasites in the host cells. These structures develop as phagolysosomes, maturing from fusion with primary and secondary endosomes and lysosomes. Among the components responsible for the biogenesis of VPs are the proton pump ATPase vacuolar (v­ATPase). These pumps are composed by the V1 domain (A­H subunits) involved in ATP hydrolysis and the V0 domain (subunit a, c, c ', d and e) engaged with the proton translocation across the membrane. Each intracellular parasite “customize” its PV either by subverting the host vesicular traffic or restricting the passage of nutrients, enzymes and protons through the vacuole. This customization should happen by the presence or not, of the parasite by its direct or indirect action of the on factors such the vATPase of the PVs membrane. In order to investigate the influence of a customized vacuole on the first pathogen on the survival and differentiation of the second, we developed an in vitro model of intracellular coinfection wish T. cruzi and L. (L.) amazonensis in RAW 264.7 macrophages.It was possible to demonstrate the formation of chimeric vacuoles containing two parasites by videomicrograph registration showing transference, differentiation and multiplication of the T. cruzi within theL. (L.) amazonensis PV. Considering that the L. (L.) amazonensis PV is acidified by action of v­ATPases, we developed a model of macrophage RAW 264.7 knock­down of v­ATPase (ATP6V0d2) in order to check whether the vacuolar acidification is decisive for the differentiation of this parasite as well as T. cruzi in a double infection model. We demonstrated that the large size of L. (L.) amazonensis PVs was dramatically reduced in macrophages silenced for this v­ATPase subunit and chimeric vacuoles could not be observed after coinfection with T. cruzi. However, in the knocked out RAW 264.7 macrophage infected with L. (L.) amazonensis the ATP6V0d2 interference increased the multiplication of amastigotes in the PV and induced the formation of tight­fitting vacuoles. The silencing of this subunit did not interfere with the phagolysosome acidification but led to the inhibition of precursor process of the mature cathepsin D, the inhibition of lysosomal acid lipase and decreased activity of cell cholesterol concentration. The results obtained show that the characteristic phagolysosome vacuoles harboring of L. (L.) amazonensis supports the differentiation of T. cruzi and the typical size of the PVs induced by this Leishmania species is dependent of v­ATPase V0d2 subunit.