Clonagem, expressão e purificação da forma ativa da enzima conversora de endotelina-1 (ECE1)

Abstract

A enzima conversora de endotelina-1 (ECE 1) e uma metaloendoprotease de membrana que catalisa a conversao das formas inativas do peptideo big-endotelina para as formas ativas de endotelina. As endotelinas (EDN) sao potentes peptideos vasoconstntores formados por 21 aminoacidos e sao produzidos por celulas endoteliais vasculares. Os peptideos desta familia estao envolvidos na regulacao da pressao arterial e podem ter papel relevante em patologias cardiovasculares e renais. O passo final do bioprocessamento das endotelinas e a conversao do precursor inativo big-endotelina para o peptideo ativo, atraves da clivagem entre o Trp2l e Va1/I1e22 pela enzima conversora de endotelina (ECE). Neste estudo, o dominio catalitico da enzima conversora de endotelina-1 (ECE1) de cerebro de rato foi amplificado por rt-PCR e clonado em vetor plasmidial de transferencia pBSV-8His. A construcao pBSV-8His-ECE1 e o DNA do baculovirus BaculoGOLD foram transfectados em celulas de inseto Sf9 em cultura de celulas em suspensao. A proteina recombinante expressa foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de niquel. A proteina recombinante obtida foi submetida a desglicosilacao enzimatica, a western blotting contra o anticorpo antiHis tag e ao espectro de absorcao de dicroismo circular, comprovando-se a ocorrencia de modificacoes pos-traducionais da proteina, a obtencao da proteina recombinante estruturada e a identificacao da proteina clonada em fusao ao His-tag. O aumento de escala de expressao, acompanhado da otimizacao da homogeneidade da purificacao da proteina expressa, serao uteis para futuras caracterizacoes bioquimicas e estruturais de ECE 1