Avaliação estrutural e novas formulações na promoção de ligações covalentes (Cross-linking) na córnea

Abstract

O presente estudo foi conduzido em quatro etapas, tendo os seguintes objetivos: 1) Avaliar as alteracoes estruturais do colageno de corneas de porcos submetidas ao Cross-linking (CXL) com riboflavina e ultravioleta-A (UVA) por meio de imunofluorescencia confocal, 2) Estudar as alteracoes do colageno corneano apos CXL em corneas com ceratopatia bolhosa, 3) Avaliar, por meio da imunofluorescencia do colageno, o efeito do epitelio como barreira para o efeito do CXL corneano, 4) Estudar a penetracao de duas novas formulacoes de riboflavina (base e fosfato) em corneas de coelhos com epitelio integro. Na primeira etapa, foram incluidos 25 olhos frescos enucleados de porcos, que foram divididos em 5 grupos, com 5 olhos cada. O epitelio foi removido em todos os olhos com excecao do grupo III. O primeiro grupo serviu de controle. O grupo II foi submetido ao CXL tradicional, no qual o epitelio foi removido e a solucao de dextranriboflavina 0.1% (10mg de riboflavina-5-fosfato em 10 ml de Dextran T-500 20%) foi instilada a cada 5 minutos por 1 hora. Apos os primeiros 30 minutos, os olhos foram expostos a irradiacao com UVA 365nm (3mW/cm2, 5.375J/cm2) por mais 30 minutos. O grupo III foi submetido ao mesmo procedimento de CXL, com a unica excecao de que o epitelio nao foi removido. Os grupos IV e V objetivaram avaliar os efeitos isolados da solucao de riboflavina (grupo IV) e da radiacao UVA (grupo V) no estroma corneano. Uma linha anterior de compactacao das fibras de colageno foi observada apenas nas corneas do grupo II. O CXL sem previa desepitelizacao nao induziu qualquer modificacao nas fibras de colageno. Na segunda etapa foram incluidos 14 corneas humanas com ceratopatia bolhosa. Em 7 delas foi realizado CXL entre 7 e 90 dias antes do transplante de cornea (TP). As outras 7 serviram de controle. A analise com imunofluorescencia mostrou uma maior compactacao e organizacao das fibras de colageno das corneas tratadas, porem este efeito nao foi homogeneo entre as corneas com diferentes graus de severidade da doenca. Alem disso, as corneas com maior intervalo de tempo entre o CXL e o TP mostraram um efeito reduzido em comparacao com as corneas com menor intervalo de tratamento. Na terceira etapa, 15 olhos frescos enucleados de porcos foram divididos em 3 grupos, com 5 olhos cada. O epitelio foi mantido integro em todos os olhos. O grupo I serviu como controle. No grupo II, foi instilado anestesico (cloridrato de tetracaina 1%) e solucao de dextran-riboflavina 0.1%, enquanto no grupo III, esta solucao foi injetada na camara anterior, para que a riboflavina se difundisse no estroma corneano atraves do endotelio. Os olhos do grupo II e III foram entao irradiados (365nm, 3mW/cm2) por 30 minutos, e foram analisados por imunofluorescencia. A compactacao das fibras de colageno foi maior no grupo III, assim como a coloracao amarelada do estroma corneano. Concluiu-se que o epitelio integro alterou o efeito do CXL por impedir a penetracao da riboflavina sem, no entanto, limitar a transmitancia da radiacao UVA. A concentracao inadequada de riboflavina no estroma corneano pode limitar o efeito do CXL. Na quarta etapa 160 olhos de coelhos foram incluidos e duas microemulsoes nanoestruturadas de riboflavinas anfifilicas foram desenvolvidas: fosfato e base. Suas caracteristicas de absorbancia e transmitancia em corneas com epitelio integro foram comparadas com a solucao de dextran-riboflavina 0.1% (padrao) e com a solucao de dextran-riboflavina 1% (concentrada). A microemulsao de riboflavina-fosfato teve uma melhor difusao pelo estroma corneano do que a base. Corneas com epitelio integro que receberam a microemulsao de riboflavina-fosfato tiveram valores de coeficiente de absorcao e transmitancia semelhantes ao tratamento tradicional em corneas desepitelizadas. Concluiu-se que, apos o CXL com solucao de riboflavina-dextran 0.1% e irradiacao UVA 365nm, houve compactacao das fibras de colageno no estroma anterior da cornea. O epitelio integro alterou este efeito por reduzir a difusao estromal da riboflavina, e nao por impedir a penetracao dos raios UVA. O efeito do CXL em corneas com ceratopatia bolhosa parece ser temporario e variar conforme a severidade da doenca. A riboflavina-fosfato nanoestruturada foi capaz de penetrar o epitelio integro de corneas de coelhos em concentracoes semelhantes as obtidas com o tratamento tradicional (riboflavina-dextran 0.1% em corneas desepitelizadas)