Caracterização do gene fosA cromossômico e avaliação da atividade sinérgica de Fosfomicina contra Klebsiella pneumoniae

Abstract

A Resistência aos Antimicrobianos (RAM) é considerada pela Organização Mundial da Saúde como uma das maiores ameaças à saúde pública. Com o acelerado surgimento de linhagens bacterianas multi- e pan-resistentes, associada ao número limitado de antimicrobianos eficazes, a busca por alternativas terapêuticas tem sido cada vez mais comum. A fosfomicina dissódica é uma opção terapêutica potencial para tratar infecções de difícil tratamento, especialmente quando combinada com outros antimicrobianos. Neste estudo, avaliamos a atividade da fosfomicina em combinação com meropenem ou polimixina B contra 17 isolados clínicos contemporâneos de K. pneumoniae produtores de KPC-2. A atividade sinérgica destes antimicrobianos foi avaliada in vitro por meio dos ensaios de checkerboard e time-kill e in vivo em Galleria mellonella. Sabendo que K. pneumoniae é considerada uma espécie reservatório do gene fosA, um gene de resistência à fosfomicina, pesquisou-se a expressão do gene fosA cromossômico por PCR quantitativo em tempo real, seu impacto no fenótipo de resistência à fosfomicina nesse patógeno, bem como o contexto genético envolvido com este gene por meio de dados obtidos do sequenciamento de genoma completo. No presente estudo, por meio da análise da sequência de fosA cromossômico, conseguiu-se diferenciar clones de K. pneumoniae do CC258/11 de outros STs, bem como identificar clones dos STs 16, 15, 307 e 101. Os resultados de sinergismo obtidos in vitro apontaram para a recuperação da atividade de meropenem e de polimixina B em 82,4% e em 47% dos isolados, respectivamente, quando combinados com fosfomicina. Observou-se sinergismo entre fosfomicina e meropenem contra 58,8% dos isolados, com redução do crescimento bacteriano variando de 3,0 a 6,7 log10 CFU/mL; e entre fosfomicina e polimixina B contra 47,1% dos isolados, com redução de 6,0 a 6,2 log10 CFU/mL, quando usadas as concentrações de pico. O ensaio em G. mellonella demonstrou atividade de fosfomicina em combinação com meropenem, uma vez que todas as larvas tratadas com essa combinação sobreviveram. Observou-se também a atividade sinérgica de fosfomicina com meropenem ou polimixina B na desestruturação do biofilme produzido por K. pneumoniae produtora de KPC (redução de 1,481 a 3,470 vezes na detecção do biofilme). Por fim, observou-se um aumento de 4,69 a 7,73 vezes na expressão de fosA nos isolados resistentes à fosfomicina. Em média, o gene fosA nos isolados resistentes à fosfomicina apresentaram-se cerca de cinco vezes mais expressos do que nos isolados sensíveis à fosfomicina. Neste trabalho demonstraram-se bons resultados in vitro e in vivo da atividade de fosfomicina em combinação com meropenem ou polimixina B, apontando para o seu promissor uso como terapia contra infecções de difícil tratamento. Entretanto, o aumento da expressão de fosA cromossômico observado nos isolados resistentes à fosfomicina apontam para a permanente necessidade de avaliação da possibilidade de surgimento de resistência à fosfomicina. Este fato reforça o uso de fosfomicina em terapia combinada para tratamento de infecções causadas por K. pneumoniae.

Antimicrobial Resistance (AMR) is considered by the World Health Organization as one of the greatest threats to the public health. With the accelerated increase on multi and panresistant bacterial pathogens, associated with the limited number of effective antimicrobials, the search for therapeutic alternatives has become increasingly common. Fosfomycin disodium is a potential therapeutic option to treat difficulttotreat infections, especially when combined with other antimicrobials. In this study, we evaluated the activity of fosfomycin in combination with meropenem or polymyxin B against 17 contemporaneous KPC2producing K. pneumoniae clinical isolates. The synergistic activity of these antimicrobials was evaluated in vitro using checkerboard and timekill assays and in vivo in Galleria mellonella. K. pneumoniae is considered a reservoir species of the fosA gene, a fosfomycin resistance gene. Thus, the expression of the chromosomal fosA gene was assessed by realtime quantitative PCR as well as its impact on the fosfomycin resistance phenotype. Also, we analyzed the fosA genetic context through the data obtained from whole genome sequencing. In the present study, through the analysis of the chromosomal fosA sequence, it was possible to differentiate clones of K. pneumoniae from CC258/11 from other STs, as well as to identify clones of STs 16, 15, 307 and 101. The results of in vitro synergism assays showed recovery of meropenem and polymyxin B activity in 82.4% and 47% of the isolates, respectively, when combined with fosfomycin. Synergism between fosfomycin and meropenem was observed against 58.8% of the isolates, with a reduction in bacterial growth ranging from 3.0 to 6.7 log10 CFU/mL; and between fosfomycin and polymyxin B against 47.1% of the isolates, with a reduction of 6.0 to 6.2 log10 CFU/mL, when using the peak concentrations. The assay with G. mellonella demonstrated fosfomycin activity in combination with meropenem, as all larvae treated with this combination survived. The synergistic activity of fosfomycin with meropenem or polymyxin B in disrupting the biofilm produced by KPCproducing K. pneumoniae was also observed (1.481 to 3.470fold reduction in biofilm detection). Finally, a 4.69 a 7.73fold increase in fosA expression was observed in the fosfomycinresistant isolates. On average, the fosA gene expression in the fosfomycinresistant isolates was about 5fold increase compared with the fosfomycinsusceptible isolates. In this work, good in vitro and in vivo results were demonstrated for the activity of fosfomycin in combination with meropenem or polymyxin B, pointing to its promising use as a therapy against difficulttotreat infections. However, the increase in chromosomal fosA expression observed in the fosfomycinresistant isolates points to the permanent need to evaluate the possibility of the emergence of fosfomycin resistance. This fact reinforces the use of fosfomycin in combination therapy for the treatment of infections caused by K. pneumoniae.