Dissertação de mestrado
Expressão de CD40 e CD40-L e produção de citocinas em pacientes com ataxiatelangiectasia
Fecha
2015-08-07Registro en:
PEREIRA, Camila Teles Machado. Expressão de CD40 e CD40-L e produção de citocinas em pacientes com ataxiatelangiectasia. 2015. 112 f. Dissertação (Mestrado em Pediatria e Ciências Aplicadas à Pediatria) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.
Autor
Pereira, Camila Teles Machado [UNIFESP]
Institución
Resumen
A deficiência imunológica que acompanha os pacientes com ataxia telangiectasia (AT) é bastante variável e geralmente combinada. As alterações humorais mais comuns incluem redução no número de linfócitos B, nos níveis de IgG, IgA e IgE e ausência de resposta a antígenos proteicos e polissacarídeos. Além disso, aproximadamente 10% dos pacientes apresenta níveis elevados de IgM, sugerindo um defeito na recombinação (ou switch) de classe dos linfócitos B, assim como ocorre na síndrome de Hiper-IgM. Diante destas alterações, objetivamos pesquisar, em pacientes com AT, algumas etapas do complexo processo que culmina com a produção de Ig, como a expressão de CD40 nas células B e CD40L nos linfócitos T e a produção de citocinas envolvidas. Materiais e Métodos. Foi coletado sangue periférico de 18 pacientes atendidos na Disciplina de Imunologia da UNIFESP e de 8 controles pareados por gênero e idade. Logo após a coleta, 5 mL eram utilizados para imunofenotipagem de linfócitos. Os outros 10 mL eram centrifugados e separados em plasma e células mononucleares periféricas (PBMC) e, então, congelados. As células mononucleares, após descongelamento, eram divididas em 2 poços, um com acetato miristato forbol (PMA) e ionomicina para estimular as células a expressarem CD40-L. Após 3 horas de ativação, as células eram marcadas com anticorpos monoclonais conjugados a fluorescência e os eventos analisados no citômetro de fluxo. Após o descongelamento do plasma, foram dosadas as citocinas envolvidas na recombinação de classe (IL-6, IFN-y e TGF-beta), e a IgM e IgA séricas. Associação linear entre IgM e expressão de CD40 foi medida através da correlação de Pearson, enquanto a correlação de Spearman foi usada para relacionar IgA e TGF-beta. Análise estatística foi realizada com os programas SPSS 20.0 e STATA 12. Resultados. A expressão de CD40 nos pacientes foi significativamente menor que nos controles (AT= 69.9%; C= 87.4%; p<0.001). Para CD40L não se observou diferença. Em relação às citocinas, não houve diferenças de médias de IL-6 (p=0,487), IFN-y (p=0,922) e TGF-beta (p=0,053) entre os grupos caso e controle. Não foi observada correlação de Pearson (rP) significante entre CD40 e IgM tanto no grupo caso (rP = 0,243, p=0,332) como no grupo controle (rP = -0,216, p=0,607), nem correlação de Spearman (rS) significante entre TGF-beta e IgA no grupo caso (rS = 0,301, p=0,225) ou no grupo controle (rS = - 0,577, p=0,134). Discussão. O padrão de anticorpos encontrado nos pacientes indica um defeito no processo de recombinação de classe. Além disso, o nível de linfócitos B foi significativamente mais baixo nos pacientes que nos controles (p<0,001), assim como a expressão de CD40 (média casos= 69,9%; média controles= 87,4%; p<0,001). Sugerimos, portanto, que além de a deficiência da ATM causar defeito no reparo do DNA, parece haver um outro defeito que contribui para a inadequada produção de anticorpos e que seria expressão deficiente de CD40 pelos linfócitos B, característica dos pacientes com SHIgM do tipo 3. The immunodeficiency presented by the patients with AT is highly variable and usually combined. The most common humoral alterations include low number of B lymphocytes, IgG, IgA and IgE and poor response to proteic and polyssacharide antigens. Beyond that, approximately 10% of the patients present with high levels of IgM, as seen in Hyper-IgM Syndrome, suggesting a defect in class-switch recombination of B lymphocytes. We, therefore, aim to analyze, in patients with AT, some steps of the complex process that culminates with Ig production, as expression of CD40 on B lymphocytes and CD40L on T lymphocytes and production of some cytokines. Materials and Methods: Peripheral blood was collected from 18 patients (from the Federal University of Sao Paulo) and 8 age-sexmatched controls. Immediately after collection, 5 mL were used for lymphocytes' immunophenotyping, while 10 ml were centrifuged and separated into plasma and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and, then, cryopreserved. Mononuclear cells were thawed and divided into 2 plates, one with phorbol myristate acetate (PMA) and ionomycin to stimulate cells to express CD40L. After 3 hours of activation, cells were stained with monoclonal antibodies conjugated to fluorochromes and events were analyzed by flow cytometry. Cytokines involved in switch class recombination (IL-6, IFN-y and TGF-beta) and serum IgM and IgA were measured in plasma. Linear association between IgM and CD40 expression was measured by Pearson correlation, while the Spearman correlation was used to correlate IgA and TGF-beta. Statistical analysis was performed with SPSS 20.0 and STATA 12 programs. Results: CD40's expression was significantly lower in patients than in controls (AT = 69.9%; C = 87.4%; p <0.001). There wasn't difference in the expression of CD40L or in the means of IL-6 (p = 0.487), IFN-y (p = 0.922) and TGF-beta (p = 0.053) between case and control groups. There was no significant Pearson correlation (rP) between CD40 and IgM both in case group (rP = 0.243, p = 0.332) and control group (rP = -0.216, p = 0.607). Similarly, there wasn't significant Spearman correlation (rS) between TGF-beta and IgA in case group (rS = 0.301, p = 0.225) nor in control group (rS = -0.577, p = 0.134). Discussion: The antibodies' pattern found in patients with AT indicates a defect in class switch recombination. Furthermore, the number of B lymphocytes was significantly lower in patients than in controls (p <0.001), as well as the expression of CD40 (mean = 69.9% cases; average = 87.4% control, p <0.001). We therefore suggest that in addition to ATM deficiency causing defects in DNA repair, there seems to be another defect that contributes to the inadequate production of antibodies and that would be deficient expression of CD40 by B lymphocytes, characteristic of patients with type 3 Hyper-IgM Syndrome.