Importância do gene WEE1 e efeitos da sua inibição na sobrevida de células-tronco tumorais do Mieloma Múltiplo

Abstract

Introduction: Multiple myeloma (MM) is characterized by the infiltration of tumor plasmacytes into the bone marrow (BM), synthesis and secretion of monoclonal immunoglobulins and tissue damage. The presence of cancer stem cells (CSCs) is indicated as the predominant cause of resistance to therapy and relapses in cancer, being a subject still little explored in MM. In previous studies of our group, MM cancer stem cells (MM-CSCs) were isolated based on the expression of CD138, CD34, CD19 and ALDH1 markers. After analysis of stemness gene expression by PCR array, 82% of the genes showed differential expression between MM-CSCs and tumor plasma cells in patient samples. Among them, the WEE1 gene, responsible for the repair of DNA in the G2 phase of the cell cycle, was identified as overexpressed in MM-CSCs in relation to tumor plasmacytes. Thus, our results suggest the WEE1 molecule as a possible therapeutic target to be explored in MM. Objectives: To identify the presence of possible MM-CSCs in MM cell lines; to evaluate WEE1 gene expression in these cells; and to perform functional studies to verify the effect of the inhibition of this gene on cell viability and its potential as therapeutic target. Materials and methods: MM cell lines were submitted to sorting by flow cytometry to identify MM-CSCs (CD138- / CD19 + / CD34 + / ALDH1 +) and soft agar culture to evaluate the formation of microspheres. WEE1 expression was evaluated in the cell lines by quantitative real-time PCR (qPCR). After treatment with the WEE1 inhibitor (MK-1775), with or without proteasome inhibitor (bortezomib) pretreatment, we assessed cell viability through Prestoblue functional test, and the induction of apoptosis and the cell cycle by flow cytometry. Results: We identified the presence of MM-CSCs (CD138- / CD34 + / ALDH1 +, CD19 negative in four wild-type MM lines), and the formation of microspheres in soft agar using RPMI-8226, U266 and SKO-007. All MM cell lines showed WEE1 expression by qPCR. RPMI-8226 and U266 showed a 50% reduction in cell viability after 24 hours of incubation with MK-1775, at concentrations of 5μM and 20μM, respectively. SKO-007 showed dose and time dependence to this drug. Combination therapy with bortezomib and MK-1775 abolished the formation of soft agar microspheres in the RPMI-8226 cell line (also responsive to the use of both drugs) and U266, but SKO-007 was resistant to all drugs, isolated and combined. Treatment of bortezomib followed by MK-1775 (sequential treatment) versus bortezomib alone showed statistically significant impact on cell lines total apoptosis: 88.8% vs 74.1% in RPMI-8222; 92.5% vs 86.6% in U266; and 60.2% 30.9% on SKO-007 (p<0.05) Conclusion: The sequential combination of bortezomib and WEE1 inhibitor, MK-1775, induced apoptosis in RPMI-8226, U266, and especially SKO-007 cell lines, more efficiently than the use of the isolated drugs, highlighting its effect in inhibition of proliferation of tumor cells in MM cell lines and, potentially, in MM-CSCs.

Introdução: O mieloma múltiplo (MM) é caracterizado pela infiltração de plasmócitos tumorais na medula óssea (MO), síntese e secreção de imunoglobulinas monoclonais e dano tecidual. A presença de células-tronco tumorais (CSCs) é apontada como a causa predominante na resistência à terapia e recidivas em câncer, sendo assunto ainda pouco explorado no MM. Em estudos anteriores do nosso grupo, as células-tronco tumorais do MM (MM-CSCs) foram isoladas com base na expressão dos marcadores CD138, CD34, CD19 e ALDH1. Após a análise da expressão de genes de stemness por PCR array, 82% dos genes apresentaram expressão diferencial entre MM-CSCs e plasmócitos tumorais em amostras de pacientes. Entre eles, o gene WEE1 que é responsável pelo reparo de DNA na fase G2 do ciclo celular, foi identificado como hiperexpresso em MM-CSCs em relação a plasmócitos tumorais. Assim, nossos resultados sugerem a molécula WEE1 como possível alvo terapêutico que pode ser explorado no MM. Objetivos: Identificar a presença de possíveis MM-CSCs em linhagens de MM, avaliar a expressão do gene WEE1 nessas células e realizar estudos funcionais para verificar o efeito da inibição desse gene na viabilidade celular e seu potencial como alvo-terapêutico. Material e Métodos: As linhagens celulares de MM foram submetidas a sorting por citometria de fluxo (CD138-/CD19+/CD34+/ALDH1+) para identificar MM-CSCs e à cultura em soft ágar para avaliar a formação de microesferas. A expressão de WEE1 foi avaliada nas linhagens celulares por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Após o tratamento com o inibidor de WEE1 (MK-1775), com ou sem tratamento prévio com inibidor de proteassoma (bortezomibe), avaliamos a viabilidade celular através do teste funcional Prestoblue, e a indução de apoptose e o ciclo celular por citometria de fluxo. Resultados: Identificamos a presença de MM-CSCs (CD138-/CD34+/ALDH1+, sendo o CD19 negativo em quatro linhagens selvagens de MM), e a formação de microesferas em soft ágar utilizando RPMI-8226, U266 e SKO-007. Todas as linhagens de MM apresentaram expressão de WEE1 por qPCR. As linhagens celulares RPMI-8226 e U266 mostraram 50% de redução na viabilidade celular após 24 horas de incubação com MK-1775, nas concentrações de 5μM e 20 μM, respectivamente. A linhagem SKO-007 apresentou dose e tempo dependência. A terapia combinada com bortezomibe e MK-1775 aboliu a formação de microesferas em soft ágar nas linhagens RPMI-8226 (também responsiva ao uso isolado dos dois fármacos) e U266, mas a linhagem SKO-007 foi resistente a todos os fármacos, isoladas e combinadas. O tratamento das linhagens com bortezomibe seguido de MK-1775 (tratamento sequencial) versus uso isolado de bortezomibe demonstrou impacto estatisticamente significante na apoptose total: 88,8% vs 74,1% na RPMI-8222; 92,5% vs 86,6% na U266; e 60,2% 30,9% na SKO-007 (p< 0,05). Conclusão: A combinação sequencial dos fármacos bortezomibe e do inibidor de WEE1, MK-1775, induziu apoptose nas linhagens celulares RPMI-8226, U266 e, principalmente, na SKO-007, de forma mais eficiente do que o uso dos fármacos isolados, evidenciando seu efeito na inibição de proliferação de células tumorais em linhagens celulares de MM e, potencialmente, das MM-CSCs.