Avaliação da ocorrência, expressão e envolvimento do operon pil na aderência de cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC)

Abstract

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) cause a characteristic intestinal lesion (attaching/effacing lesion) and are identified by the production of the localized adherence pattern (LA) on HeLa cells. On the other hand, enteroaggregative E. coli (EAEC), which are emerging pathogens that can cause persistent diarrhea and that colonize the intestinal mucosa by forming biofilms, produce the aggregative adherence pattern (AA). Our group has previously identified EPEC strains of the O119:H6 serotype that produce a hybrid adherence pattern, i.e., LA and a pattern similar to AA (AAlike) simultaneously (AL/ AAlike +). The horizontal transfer of plasmid pGM80 from an O119:H6 LA/AAlike+ strain to a nonadherent E. coli strain generated AAlike+ transconjugants. This plasmid carries the pil operon, which encodes a variant of Pil, a type IV fimbriae responsible for the AA phenotype in some EAEC strains. In this study, we evaluated the distribution of the pil operon in EPEC strains (22 serotypes, 14 geographic regions, isolated between 1950 and 2015) as well their expression and spreading ability by conjugation. PCR of two previously described pilS alleles (pilSEc404 and pilSC1096), the Pil’s pilin encoded gene, revealed its presence in ~ 54.5% of the 164 analysed strains, with pilSEc404 and pilSC1096 occurring at similar frequencies (~ 30 % and 25%, respectively). The pilSEc404 (76%) and pilSC1096 (46%) alleles were more frequent in O119: H6 and O111:H2, respectively. The pilS + strains were isolated in Chile, Peru and in different Brazilian cities, with the oldest isolated in 1966. There was no absolute relationship between the presence of pilS and the AAlike phenotype in HeLa cells, as this phenotype was also observed in some pilS negative strains, while some LA positive strains showed pilS. Quantitative analyzes of the expression of six essential genes for the assembly of Pil (piLN, pilQ, pilR, pilS, pilU and pilV) by qRTPCR between three LA+ strains and three LA/ AAlike+ strains showed no correlation in the expression of these genes and the AAlike phenotype. The potential involvement of pilV subtypes (which encodes the Pil adhesin) in the AAlike phenotype was also evaluated. In brief, the pil operon was found to occur more frequently in the classical serotypes of EPEC and it was confirmed that the pilV subtypes and specific variations in the adhesin composition of the Pil fimbriae was not related to the formation of the AAlike phenotype in the analysed strains. In addition, a fine regulation of the pil genes is probably necessary for the production of functional Pil fimbriae and the spread of these genes.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) causa lesão intestinal característica (lesão attaching/effacing), sendo identificada pela produção do padrão de aderência localizada (AL) em células HeLa. Por sua vez, E. coli enteroagregativa (EAEC), patógeno emergente que pode causar diarreias persistentes, colonizando a mucosa intestinal e formando biofilmes, produzemo padrão de aderência agregativa (AA). Nosso grupo identificou, anteriormente, cepas de EPEC do sorotipo O119:H6 que produzem um padrão híbrido de aderência, isto é, AL e um padrão semelhante ao AA (AAlike) simultaneamente (AL/AAlike+). Também demonstrou que a transferência horizontal do plasmídeo pGM80 de uma cepa O119:H6 AL/AAlike+ para uma cepa de E. coli não aderente gerou transconjugantes AAlike+. Esse plasmídeo é portador do operon pil, que codifica uma variante de Pil, fímbria do tipo IV responsável pelo fenótipo AA em algumas cepas de EAEC. Neste estudo, avaliamos a distribuição do operon pil em cepas de EPEC (22 sorotipos, 14 regiões geográficas, isoladas entre 1950 e 2015) bem como sua expressão e capacidade de disseminação por conjugação. A pesquisa por PCR dos dois alelos conhecidos de pilS (pilSEc404 e pilSC1096), gene que codifica a pilina de Pil, revelou sua presença em ~54,5% das 164 cepas estudadas, sendo que pilSEc404 e pilSC1096 ocorreram em frequências semelhantes (~30% e 25%, respectivamente). Os alelos pilSEc404 (76%) e pilSC1096 (46%) foram mais frequentes em O119:H6 e O111:H2, respectivamente. As cepas pilS+ foram isoladas no Chile, no Peru e em diferentes cidades do Brasil, sendo que a mais antiga foi isolada em 1966. Não houve relação absoluta entre presença de pilS e do fenótipo AAlike em células HeLa, pois este fenótipo foi também observado em algumas cepas pilS negativas, enquanto algumas cepas AL positivas (AL+) apresentaram pilS. Análises quantitativas da expressão de seis genes essenciais para a montagem de Pil (piLN, pilQ, pilR, pilS, pilU e pilV) por qRTPCR, entre três cepas AL+ e três AL/AAlike+, demonstraram não haver correlação nos níveis de expressão desses genes e o fenótipo AAlike. Foi também avaliado o potencial envolvimento dos subtipos de pilV (que codifica a adesina da fímbria) no fenótipo AAlike, pela análise de seus diferentes alelos e correlação com o fenótipo. Em resumo, verificouse que operon pil ocorreu mais frequentemente nos sorotipos clássicos de EPEC e confirmouse que os subtipos de pilV e, por consequência, a variações na composição da adesina da fímbria Pil não estariam relacionados com a formação de AAlike nas cepas estudadas. Além disso, uma fina regulação dos genes pil é provavelmente necessária para a produção de fímbrias Pil funcionais e na disseminação desses genes entre bactérias.