Vesículas extracelulares de Leishmania amazonensis: papel de fatores de virulência na ativação de macrófagos murinos

Abstract

As leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania. A infecção ocorre quando os parasitas são transmitidos para o hospedeiro vertebrado durante o repasto sanguíneo do vetor. Após a infecção, os parasitas são fagocitados por células especializadas, como os macrófagos, e iniciam seu processo de diferenciação celular. A fim de evitar a ativação do sistema imunológico, os parasitas utilizam mecanismos, como vesículas extracelulares (VEs), que contêm fatores de virulência do patógeno e interagem com macrófagos e outras células do sistema imunológico. Neste estudo, foram avaliadas a internalização de VEs pelas células murinas RAW 264.7, as citocinas e quantidade de NO liberadas pelas células RAW 264.7 estimuladas com VEs liberadas por Leishmania amazonensis com distintos perfis de virulência (perfil virulento - IVD-P e perfil atenuado - LT-P) e citocinas liberadas por RAW 264.7 estimuladas com VEs e infectadas com os parasitas de mesmo perfil de virulência. Por microscopia confocal e citometria de fluxo, foi demonstrada a internalização de VEs LT-P e IVD-P por macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7. Com relação a ativação dessas células por VEs, foi observado aumento na taxa de NO produzido por macrófagos estimulados com VEs de parasitas LT-P, o que pode sugerir a ativação do macrófago pelas VEs ou inferir que as VEs de parasitas IVD-P foram capazes de modular a resposta dos macrófagos para um ambiente mais favorável para presença do parasita. Também foi demonstrado aumento significativo da produção de TNF-α, IL-6, IL-10 e MCP-1 em macrófagos estimulados com VEs de parasitas LT-P, divergindo do observado com VEs IVD-P, que não apresentaram aumento significativo de nenhuma citocina, sugerindo que VEs IVD-P podem estar subvertendo a resposta protetora de macrófagos. Em macrófagos estimulados com VEs LT-P e infectados com os parasitas LT-P, nossos resultados mostraram aumento na produção de TNF-α, IL-6, e MCP-1, diferentemente dos tratados com VEs IVD-P e infectados com IVD-P, em que houve aumento na produção de TNF-α e MCP-1. Esses resultados sugerem que VEs de perfis de virulência LT-P e IVD-P modulam macrófagos de forma diferente. Assim, nosso trabalho abre uma nova perspectiva na ativação de macrófagos por VEs de L. amazonensis podendo no futuro contribuir para o desenvolvimento de terapias alternativas e de vacinas para leishmaniose cutânea.

Leishmaniasis are diseases caused by protozoa of the genus Leishmania. Infection occurs when the parasites are transmitted to the vertebrate host during the vector's blood meal. After infection, the parasites are phagocytosed by specialized cells, such as macrophages, and begin their cell differentiation process. In order to avoid activation of the immune system, parasites use mechanisms such as extracellular vesicles (EVs), which contain pathogen virulence factors and interact with macrophages and other cells of the immune system. In this study, we evaluated the internalization of EVs by murine RAW 264.7 cells, the cytokines and amount of NO released by RAW 264.7 cells stimulated with EVs released by Leishmania amazonensis with different virulence profiles (virulent profile - IVD-P and attenuated profile - LT -P) and cytokines released by RAW 264.7 stimulated with EVs and infected with parasites of the same virulence profile. Confocal microscopy and flow cytometry demonstrated the internalization of LT-P and IVD-P VEs by murine macrophages of the RAW 264.7 lineage. Regarding the activation of these cells by EVs, an increase in the rate of NO produced by macrophages stimulated with EVs from LT-P parasites was observed, which may suggest macrophage activation by EVs or infer that EVs from IVD-P parasites were capable of modulating the response of macrophages to a more favorable environment for the presence of the parasite. A significant increase in the production of TNF-α, IL-6, IL-10, and MCP-1 was also demonstrated in macrophages stimulated with EVs from LT-P parasites, in contrast to what was observed with IVD-P EVs, which did not show a significant increase in any cytokine. This suggests that IVDP EVs may be subverting the protective response of macrophages. In macrophages stimulated with LT-P EVs and infected with LT-P parasites, our results showed an increase in the production of TNF-α, IL-6, and MCP-1, in contrast to those treated with IVD-P EVs and infected with IVD-P, where there was an increase in the production of TNF-α and MCP-1. These results suggest that EVs from LT-P and IVD-P virulence profiles modulate macrophages differently. Thus, our work brings a new perspective on the activation of macrophages by EVs of L. amazonensis and can, in the future, contribute to the development of alternative therapies and vaccines for cutaneous leishmaniasis.