Padronização de um teste imunoenzimático para detecção da Klebsiella pneumoniae carbapenemase em isolados clínicos

Abstract

Introduction: Treatment with ceftazidime-avibactam is indicated for serious infections caused by gram-negative bacteria producers of class A (KPC, BKC, GES-5) and D (OXA-48) carbapenemases. In this way, it is clinically important to define the class of carbapenemases.Currently, many tests are commercially available for detection of carbapenemase production, but few have the ability to differentiate the b-lactam class. Objective: Standardization of a new enzyme-linked immunosorbent test (ELISA) for detection of KPC in clinical samples. Methods: We carried out the cloning, expression and purification of the KPC-2 protein in E. coli (BL21D3E). We performed immunization in Balb/c mice and New Zealand rabbits using aluminum hydroxide as adjuvant. Purification of antibodies from both animals was performed using the G-Sepharose column by the AKTA equipment. We performed block titration to assess competition between epitopes and the optimal concentration for rKPC recognition. We standardized the concentration of primary and secondary antibodies in the ELISA plate and evaluated four different methods for preparing the isolates, namely: direct growth from the Müeller-Hinton agar plate, growth on Müeller-Hinton broth, pre-inoculum followed by growth at OD of 1.0, and pre-inoculum followed by growth by 18 hours. We evaluated the sensitivity and specificity of the ELISA test using 45 producers of KPC variants and 75 not producers of KPC being 29 isolates producers of different carbapenemases; 18 isolates with resistance to carbapenems, but without the production of carbapenemases; 17 isolates producers of ESBL (blaCTX-M-like and blaSHV- 18); 2 isolates with alterations of (OmpK35 and/or OmpK36); and 12 isolates susceptible to to carbapenems. Sensitivity, specificity and optimal cut-off were determined by the ROC curve and Cohen's Kappa coefficient was used for the correlation between ELISA and PCR results. We used Student's t test to compare mean absorbances between carbapenemase-producing and non-producing isolates. Results: The antibodies developed did not show competition for epitopes and crossreaction. Among the four sample preparation methods evaluated, only one, growth on the Mueller-Hinton plate, did not show the ability to differentiate between producers and non-producer of KPC. The perfomance of the ELISA test showed 100% sensitivity and 84% specificity. Conclusion: Our work indicated that the ELISA may be a useful tool for detection of different KPC variants in bacterial isolates. Further studies are needed for optimization of sample preparation and development of monoclonal antibodies to improve test specificity and further development of immunochromatographic assays.

Introdução: A disponibilidade das novas combinações de b-lactâmicos com inibidores de b-lactamases, como ceftazidima-avibactam, para tratamento das infecções graves causadas por bactérias gram-negativas produtoras de carbapenemases tornou importante a determinação da classe das carbapenemases. Existe hoje um amplo número de testes disponíveis para detecção dessas enzimas, porém poucos possuem a capacidade de diferenciá-las. Objetivo: Padronização de um novo teste imunoenzimático (ELISA) para detecção da produção KPC em isolados clínicas. Métodos: Realizamos a clonagem, expressão e purificação da proteína KPC- 2 em E. coli (BL21D3E). Realizamos a imunização em camundongos Balb/c e coelhos Nova Zelândia utilizando hidróxido de alumínio como adjuvante. A purificação dos anticorpos de ambos os animais foi realizada utilizando a coluna G-Sepharose pelo equipamento AKTA. Realizamos a titulação em bloco para avaliar competição entre epítopos e a concentração ótima para o reconhecimento da rKPC. Padronizamos a concentração de anticorpos primários e secundários na placa de ELISA e avaliamos quatro diferentes métodos de preparo dos isolados, sendo: crescimento em placa de agár Müeller-Hinton; crescimento em caldo de Müeller-Hinton; pré-inóculo seguido do crescimento até a DO de 1.0 e pré-inóculo seguido do crescimento por 18 horas Avaliamos a sensibilidade e especificidade do teste de ELISA utilizando 45 isolados produtores de KPC e 75 isolados não produtores de KPC, sendo 29 isolados produtores de diferentes carbapenemases; 18 isolados resistentes aos carbapenêmicos, mas não produtores de carbapenemases; 17 isolados produtores de ESBL (blaCTX-M-like e blaSHV-18); 2 isolados com alterações nas porinas OmpK35 e/ou OmpK36); e 12 isolados sensíveis aos carbapenêmicos. A sensibilidade, especificidade e cut-off ótimo foi determinado pela curva ROC e o coeficiente de Kappa de Cohen foi utilizado para a correlação entre os resultados do ELISA e da PCR. Utilizamos o teste t de Student para comparação das médias das absorbâncias entre os isolados produtores e não produtores de carbapenemases. Resultados: Os anticorpos desenvolvidos não apresentaram competição por epítopos e reação cruzada entre sí. Entre os quatro métodos de preparo de amostra avaliados, apenas um (crescimento em placa de agár Müeller-Hinton) não não foi capaz de diferenciar os isolados produtores dos não produtores de KPC. A perfomance do teste de ELISA apresentou 100% de sensibilidade e 84% de especificidade. Conclusão: Nosso trabalho indicou que a técnica de ELISA pode constituir uma ferramenta útil na detecção de diferentes variantes de KPC em isolados bacterianos. Mais estudos são necessários para a otimização da preparação da amostra e o desenvolvimento de anticorpos monoclonais para a melhoria da especificidade do teste e realização futura de testes imunocromatográficos.