masterThesis
Avaliação da genotoxicidade do inibidor de tripsina isolado de semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) e do potencial antibacteriano in vitro e in silico de seus peptídeos derivados
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OLIVEIRA, Gerciane Silva de. Avaliação da genotoxicidade do inibidor de tripsina isolado de semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) e do potencial antibacteriano in vitro e in silico de seus peptídeos derivados. Orientador: Ana Heloneida de Araújo Morais. 2022. 111f. Dissertação (Mestrado em Nutrição) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2022.
Autor
Oliveira, Gerciane Silva de
Resumen
Bacterial infections have become a global dimension. As a result, the
search for natural and biologically safe therapeutic agents with antibacterial
action, such as protease inhibitors, is growing. The genotoxicity of the trypsin
inhibitor isolated from tamarind seeds (ITT) was evaluated and the antibacterial
effect of its produced peptides was investigated in vitro and in silico. For this,
initially, the ITT was obtained by trypsin-Sepharose4B chromatography and
identified. Biological safety of 2-dimethyl by blocking ITT cytotoxicity by 3-(4,5-
dimethylthiazol-yl)-2,5-tetrazobromide (MTT) method and genotoxicity by
micronucleus assay with cytokinesis (CBMN) in CHO-K1 cells, using 0.3 and 0.6
mg/ml. The digestion pattern of the ITT was hydrolysis by means of digestion of
the simulated digestion in vitro, simulating the oral protocol, protein and intestinal
phases INFOEST, however, digestion fluids were not used for digestion. For
determination of digested TT enzyme was monitored/conceivable molecular
mass and inhibitory inhibitory activity on trypsin. An in vitro antibacterial activity
was tested for the hydrolyzed ITT. For cleavage we used the ITT theoretical, and
conformation, 2 2 2Tp 567 theoretical model (being a trip/cleavage number and
theoretical model) using a trip number defined by 587, using a determined trip
number (analysis determination and model), using the ExPASy server's
PeptideCutter parsing tool. Subsequently, to select the peptide with antibacterial
potential, these were aligned with the ITTp56/287 to identify the positions of the
amino acid residues using the peptide with the highest antibacterial potential that
did not follow for the molecular one (DM) using the GROMACS package. ITT
(0.0/mL, 0.0/mL) Diurnal cell viability and did not change 0.0 mg, while 0.0
changed in cells, gas and oral intact intestinal enzymes (trypsin and trypsin) were
performed TT in cleave the I. The hydrolyzed ITT activity (7mg/mL) evaluated for in vitro antibacterial activity against E. faecalis, S. aureus and S. epidermidis, in
bacteriostatic or bactericidal activities. In the silica analysis, Peptidetripchyme59
(TVSQTPIDIPIGLPVR) showed amphipathic amino acid elements,
hydrophobicity 0.636 and α-helix structure. In DM, Peptidotrychyme59 showed
an interaction potential (EPI) of -518.08 kcal.mol-1 with a Gram-positive bacterial
membrane and the threonine and arginine residues showed the best EPI,
demonstrating great antimicrobial potential. Therefore, the results bring new
perspectives of studies and applications for the ITT and its derived peptides on
the antibacterial activity which has great importance in the scientific community,
since, for the scientific community to be useful in the development of new
therapeutic agents with potential of use to reduce the high mortality rate resulting
from microbial infections. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq As infecções bacterianas têm se tornado uma preocupação global.
Em virtude disso, a busca por agentes terapêuticos naturais e seguros
biologicamente com ação antibacteriana, tais como os inibidores de proteases,
é crescente. No presente estudo avaliou-se a genotoxicidade do inibidor de
tripsina isolado de sementes de tamarindo (ITT) e investigou-se in vitro e in sílico
o efeito antibacteriano dos seus peptídeos derivados. Para tal, inicialmente, o
ITT foi obtido por cromatografia de afinidade tripsina-Sepharose 4B e
identificado. A segurança biológica foi avaliada por meio da citotoxicidade do ITT
pelo método colorimétrido de brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-
difeniltetrazólio (MTT) e genotoxicidade por meio do ensaio de micronúcleo com
bloqueio de citocinese (CBMN) em células CHO-K1, utilizando 0,3 e 0,6 mg/mL.
O padrão de digestão do ITT foi estabelecido por meio da digestão simulada e
hidrólise proteolítica in vitro, simulando as fases oral, gástrica e intestinal
conforme protocolo da INFOGEST, no entanto, para a hidrólise não foram
utilizados os fluidos da digestão. Para determinação da susceptibilidade
enzimática o ITT digerido/hidrolisado foi monitorado por análises de massa
molecular e atividade inibitória sobre a tripsina. Foi testada a atividade antibacteriana in vitro para o ITT hidrolisado. Para a clivagem in sílico foi utilizado o
modelo teórico do ITT, número 56, e conformação número 287 (ITTp 56/287)
sendo submetido a clivagem teórica com a combinação de tripsina e
quimotripsina (determinado pela digestão simulada), utilizando a ferramenta de
análise PeptideCutter do servidor ExPASy. Posteriormente, para selecionar o
peptídeo com potencial antibacteriano, esses foram alinhados com o ITTp
56/287 para identificação das posições dos resíduos de aminoácidos utilizando
o servidor CLUSTAL W e após selecionar o peptídeo com maior potencial
antibacteriano seguiu-se para a dinâmica molecular (DM) usando o pacote GROMACS. O ITT (0,3 e 0,6 mg/mL) não alterou a viabilidade celular e nem
tampouco genotoxicidade nas células (p<0,05), quando digerido/hidrolisado in
vitro se manteve íntegro na fase oral e gástrica, enquanto as enzimas intestinais
(tripsina e quimotripsina) foram eficazes em clivar o ITT. O ITT hidrolisado
(7mg/mL) avaliado quanto a atividade antibacterina in vitro contra E. faecalis, S.
aureus e S. epidermidis, nas concentrações testadas não apresentou atividade
bacteriostática ou bactericida. Na análise in silico o Peptídeotripquimo59
(TVSQTPIDIPIGLPVR) apresentou resíduos de aminoácidos anfipáticos,
hidrofobicidade 0,636 e estrutura α- hélice. Na DM o Peptídeotripquimo59
apresentou energia potencial de interação (EPI) de -518,08 kcal.mol-1 com a
membrana de bactérias Gram-positiva e os resíduos treonina e arginina
apresentaram as melhores EPI, demonstrado grande potencial antimicrobiano.
Portanto, os resultados trazem novas perspectivas de estudos e aplicações para
o ITT e seus peptídeos derivados sobre a atividade antibacteriana o qual
apresenta grande importância na comunidade científica, uma vez que, para a
comunidade científica para ser útil no desenvolvimento de novos agentes
terapêuticos com potencial de uso para diminuir a alta taxa de mortalidade
decorrente das infecções microbianas.