The geomorphological processes that occur in the formation of environments affect the evolutionary history of the species, which in the case of freshwater is even more effective, and can refer to the connection or separation of the hydrographic basins in the past. Since these processes affect the distribution, abundance and diversification of fish in these geographical regions. In this regard, the objective of the present work was to infer the diversity and variability of Astyanax bifasciatus along the Iguaçu river basin. For this, was used morphometric analyzes related to the body and head size of the individuals of the upper, middle and lower regions of the Iguaçu river basin. And cytogenetic analyzes, including conventional staining with Giemsa, localization of nucleolar organizer regions by impregnation with silver nitrate, detection of constitutive heterochromatin by C-banding method and fluorescent in situ hybridization using rDNA probes 5S and 18S, snDNA U2 gene and telomeric DNA sequences. The results of the morphological analyzes indicated a significant differentiation between the populations of A. bifasciatus of the three regions of the Iguaçu river basin, the location of the flippers being the most variable character. The cytogenetics revealed the same diploid number of chromosomes (50) for the populations of the middle and upper regions of the Iguaçu river, as well as the same fundamental number (86) and karyotype formula (6m+24sm+6st+14a). Already the population of the lower region of the Iguaçu river had a diploid number of 48 chromosomes, NF=82 and FC=6a+22sm+6st+14a. The Ag-NORs were multiple for the medium population of the Iguaçu river, and simple for those upper and lower populations of the Iguaçu river, with their locations coincident with 18S rDNA. The C-banding demonstrated centromeric and pericentromeric markers for the three populations of the Iguaçu river, as well as heterogeneous telomeric markers between them. The 5S and 18S markers were variable for the populations of the Iguaçu river, with 5S markers coincident with heterochromatic sites in all populations. The U2 snDNA sites were variable between the populations, with their location in one chromosomal pair in the population of the middle region of the Iguaçu river and only one homologous in the other populations. The mapping of telomeric DNA in the lower population of the Iguaçu river revealed markers in the telomeric region of the most of chromosomes, as well as in the centromeric region of a chromosomal pair. These different levels of analysis showed a great differentiation between the populations of A. bifasciatus of the medium and lower regions of the Iguaçu river, probably arising to tectonic events that occurred in the region.Os processos geomorfológicos que ocorrem na formação dos ambientes afetam a história evolutiva das espécies, o que no caso das espécies de peixes dulcícolas é ainda mais efetivo, podendo remeter à ligação ou separação das bacias hidrográficas no passado. Uma vez que tais processos afetam a distribuição, abundância e diversificação dos peixes nestas regiões geográficas. Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi inferir a diversidade e variabilidade de Astyanax bifasciatus ao longo da bacia hidrográfica do rio Iguaçu. Para isto, foram utilizadas análises morfométricas relacionadas ao tamanho do corpo e da cabeça dos indivíduos do alto, médio e baixo rio Iguaçu. Além de análises citogenéticas, incluindo a coloração convencional com Giemsa, a localização das regiões organizadoras de nucléolo por impregnação com nitrato de prata (Ag-RONs), a detecção da heterocromatina constitutiva pelo bandamento C, e a hibridização in situ fluorescente com sondas de DNAr 5S e 18S, do gene DNAsn U2 e de sequências de DNA telomérico. Os resultados das análises morfológicas indicaram significativa diferenciação entre as populações de A. bifasciatus das três regiões da bacia do rio Iguaçu, sendo a localização das nadadeiras o caráter mais variável. A citogenética revelou mesmo número diplóide de cromossomos (50) para as populações do médio e alto rio Iguaçu, assim como mesmo número fundamental (86) e fórmula cariotípica (6m+24sm+6st+14a). Já a população do baixo rio Iguaçu teve número diploide de 48 cromossomos, NF=82 e FC=6a+22sm+6st+14a. As Ag-RONs foram múltiplas para a população do médio Iguaçu e simples para as do alto e baixo Iguaçu, com sua localização em sua maioria coincidente com o DNAr 18S. O bandamento C demonstrou marcações centroméricas e pericentroméricas para as três populações, assim como marcações teloméricas heterogêneas entre elas. As marcações de 5S e 18S foram variáveis, com marcações de 5S coincidindo a sítios heterocromáticos em todas as populações. Os sítios de DNAsn U2 foram variáveis entre as populações, com sua localização em um par cromossômico na população do médio Iguaçu e em apenas um homólogo nas demais. O mapeamento do DNA telomérico na população do baixo rio Iguaçu, revelou marcações na região telomérica da maioria dos cromossomos, bem como, na região centromérica de um par cromossômico. Portanto, estes diferentes níveis de análise demonstraram grande diferenciação entre as populações de A. bifasciatus do alto, médio e baixo rio Iguaçu, provavelmente em decorrência de eventos tectônicos ocorridos na região.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior