RESUMEN: Conocer en detalle los mecanismos regulatorios que rigen la fisiología y adaptación de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) podrían aportar ideas en el establecimiento de nuevas formas para el control de la enfermedad. Los small RNAs (sRNAs) son transcritos que han sido implicados en la regulación de la expresión génica, principalmente al interferir con la traducción de RNAs mensajeros. En Mtb se han descrito la función de dos sRNAs, Mcr7 y MrsI. El primero implicado en la secreción tipo TatABC, relacionada con la virulencia y el segundo implicado en la adaptación anticipada de Mtb a condiciones de limitación de hierro. En nuestro laboratorio se han venido estudiando dos aislados clínicos, UT205 y UT127, debido a que UT205 muestra características que pueden asociarse con una mayor virulencia comparado con UT127. Al caracterizar estas dos bacterias a nivel genómico y transcriptómico, encontramos que el sRNA Mcr11 está 2.9 veces sobre-expresado en UT205 con respecto a UT127. En la literatura encontramos que este sRNA, ubicado entre los genes rv1264, un adenilato ciclasa (AC), y rv1265, el factor de transcripción AbmR, está únicamente presente en micobacterias del complejo Mtb y se ha planteado que su función reguladora está inmersa en el metabolismo del AMPc. Esta idea apoyada también en reportes que muestran cómo la expresión de Mcr11 se modula dependiendo de las concentraciones de AMPc en el medio y de la presencia de la AC Rv1264. Sumado a esto, Mcr11 parece responder ante condiciones de estrés al modular su expresión en condiciones de pH bajo, hierro y nutrientes limitados, en dormancia y además responde a la fase de crecimiento, mostrando mayores niveles de expresión en la fase estacionaria. Adicionalmente, se ha encontrado que Mcr11 se expresa durante una infección en ratones. Con este panorama, queda claro que la red de regulación en la que puede estar participando Mcr11 tiene el potencial de ser relevante en la patogénesis de la enfermedad. Usando la técnica de silenciamiento génico CRISPRi, tratamos de determinar la función de Mcr11. Cuando silenciamos este sRNA en los dos aislados clínicos mencionados y la cepa de laboratorio H37Rv, observamos un defecto en el crecimiento principalmente en UT205. También, encontramos un fenotipo de agregación para esta bacteriana, cuando aumentamos la concentración del inductor del sistema CRISPRi. Al determinar los genes diferencialmente expresados por RNA-seq en las tres bacterias nombradas tras el silenciamiento de Mcr11, identificamos ciertas similitudes entre UT127 y H37Rv, mientras que en el caso de UT205 se presentó un efecto mucho más profundo, con una gran cantidad de genes regulados negativamente, incluyendo en este grupo, 23 genes esenciales, genes asociados a el metabolismo y producción de energía, proteínas ribosomales, componentes de pared y membrana celular, genes asociados a virulencia, entre otros. Uno de los genes más interesantes que mostró regulación positiva en UT127 y H37Rv (y parcialmente en UT205) y que además, nosotros postulamos como un posible candidato para ser regulado por Mcr11, es el gen oprA, un osmosensor que se sobre-expresa en condiciones de estrés osmótico. OprA se ha asociado a cambios en la estructura del peptidoglicano de la pared celular de Mtb, que lleva a una alteración osmótica y cambios morfológicos. Al buscar en la literatura hemos encontrado similitudes entre los perfiles transcripcionales de diferentes bacterias y Mtb, en respuesta al estrés osmótico y los encontrados en nuestras bacterias cuando silenciamos Mcr11. También, similar a nuestros resultados, el estrés osmótico genera una disminución en la tasa de crecimiento de las bacterias. La regulación del potasio es uno de los mecanismos bacterianos más importantes en respuesta al estrés osmótico, específicamente, al importar este ion del compartimento extracelular. Uno de los transportadores de potasio al interior de las bacterias en KdpD, una proteína trans-membrana que también hace parte del sistema de dos componentes KdpDE. Al analizar la secuencia nucleotídica de KdpD entre las tres bacterias, encontramos que UT205 posee una deleción de 13 nucleótidos que generan una proteína inactiva. Asociamos que la falta de este sistema de regulación de potasio en UT205 puede ser la responsable de la respuesta claramente distinta entre esta bacteria y UT127-H37Rv, cuando se silencia la expresión de Mcr11. Proponemos entonces, que una de las funciones de Mcr11 se asocia con el gen oprA, evitando que se produzca la proteína al interferir con su traducción y de esta forma, manteniendo sus niveles bajos. Esto permite que la bacteria mantenga su regulación osmótica controlada. Por otro lado, cuando Mcr11 sufre una disminución en su transcripción, los niveles de la proteína OprA aumentan. Como consecuencia la bacteria sufre cambios estructurales a nivel de la pared celular y con ello, disminuye su capacidad para mantener controlada su regulación osmótica, llevando a que Mtb disminuya su crecimiento. En el caso de UT127 y H37Rv al poseer transportadores de potasio funcionales, son capaces de sobrellevar el estrés. De manera distinta, UT205 con un KdpD inactivo, no es capaz de regular sus concentraciones de potasio y, en consecuencia, el estrés osmótico genera un estado fenotípico y transcripcional con un mayor nivel de afectación. Finalmente, determinamos el nivel de viabilidad de las células THP-1 al ser infectadas con el aislado clínico UT205 con silenciamiento de Mcr11. Encontramos que, en estas condiciones, la viabilidad de las células aumenta en comparación a células infectadas con UT205 control. Este fenómeno lo asociamos a la represión de genes asociados a la virulencia de Mtb cuando existe un silenciamiento del sRNA de estudio.PROYECTO MARCO-COLCIENCIAS : Asociación de genes de Mycobacterium tuberculosis involucrados en la síntesis de lípidos, con la formación de biopelículas, muerte celular y producción de vesículas de membrana, en dos aislados clínicos colombianos modificados empleando el sistema CRISPR-Cas9