ABSTRACT: Anopheles punctimacula s.l. is a locally important malaria vector in Colombia. Despite its epidemiological importance, little is known about its genetic variability in the malaria endemic areas where it is present. Amongthese, El Bajo Cauca - Alto Sinú regions report the highest number of malaria cases in the country. Therefore, the aim of this work was to evaluate genetic variability of An. punctimacula s.l. in two localities of each region, Nechí and Montería. This information will guide the design of targeted and effective vector control measures. Materials and methods Starting with the DNA of 20 An. punctimacula s.l., females, fragments of the mitochondrial gene COI and nuclear CPS-CAD were amplified. Nucleotide diversity, haplotype diversity, genetic structure and gene flow parameters were estimated for the populations. Results Eighteen nucleotide sequences were obtained for each marker with a size of 719 bp for CPS-CAD and 1,158 bp for COI. In the CPS-CAD sequences four polymorphic sites were detected and in COI, six. The genetic structure analyses for CPS-CAD (FST= 0.00054) and COI (FST= 0.00049) indicated lack of genetic differentiation and the Nm values (CPS-CAD= 7,78562; COI= 780,5199), evidenced high gene flow between the An. punctimacula s.l. populations of both municipalities. Conclusions Because of the low population structure detected and the high gene flow between the An. Punctimacula s.l. populations from Nechí and Montería suggest that they are genetically similar.RESUMEN: Anopheles punctimacula s.l. es un vector de la malaria de importancia local en Colombia. A pesar de su importancia epidemiológica, se conoce poco sobre su variabilidad genética en las áreas endémicas para la malaria donde se encuentra presente. Entre estas, las regiones de El Bajo Cauca y Alto Sinú son las que reportan el mayor número de casos anuales de malaria en el país. Por ello, el objetivo de este trabajo fue evaluar la variabilidad genética de An. punctimacula s.l. en dos localidades de cada región, Nechí y Montería. El conocimiento obtenido permitirá orientar el diseño de medidas de control vectorial dirigidas y efectivas. Materiales y métodos A partir del ADN de 20 hembras de Anopheles punctimacula s.l., se amplificaron los fragmentos del gen mitocondrial COI y el nuclear CPS-CAD. Se estimaron parámetros de diversidad nucleotídica, diversidad haplotípica, estructura genética y flujo de genes para las poblaciones. Resultados Se obtuvieron 18 secuencias de cada marcador; de un tamaño de 719 pb para el gen CPS-CAD y de 1.158 pb para COI. En las secuencias CPS-CAD se detectaron cuatro sitios polimórficos y en las de COI, seis. Los análisis de estructura genética para CPS-CAD (FST= 0,00054) y COI (FST= 0,00049;), indicaron ausencia de diferenciación genética y los valores de Nm (CPS-CAD= 7.78562; COI= 780.5199), evidencian un alto flujo de genes entre las poblaciones de An. punctimacula s.l. de ambos municipios. Conclusiones Dada la baja estructuración detectada y el alto flujo de genes entre las poblaciones de An. punctimacula s.l. de Nechí y Montería sugieren que ellas son genéticamente similares.COL0013746