209 P?ginasRecurso Electr?nicoEntre los vectores de Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, el g?nero Rhodnius es de gran importancia, puesto que sus especies se distribuyen en todas las regiones geogr?ficas de Colombia y particularmente R. prolixus ha logrado colonizar los domicilios humanos de las zonas end?micas del pa?s. En Colombia, la enfermedad de Chagas es principalmente causada por el genotipo I de T. cruzi, ya que circula en ambientes dom?sticos y silvestres, haciendo parte de cerca del 80% de los aislados de insectos vectores. El linaje II de T. cruzi ha sido detectado en mam?feros, vectores silvestres y causando infecciones en pacientes Chag?sicos en Colombia, desconoci?ndose sus mecanismos de circulaci?n. De conformidad con lo anterior, es necesario estudiar la capacidad vectorial de las especies domiciliadas y silvestres de los triatominos de Colombia, para conocer su papel en la transmisi?n de este genotipo. En el presente trabajo, se estudi? la metaciclog?nesis in vivo de T. cruzi I y T. cruzi II en R. prolixus domiciliado. Ciento noventa y ocho ninfas de tercero a quinto estadio de R. prolixus mantenidas en el laboratorio y libres de infecci?n con flagelados, se alimentaron sobre ratones infectados con las cepa MHOM/C0/04/MG de T. cruzi I o con la cepa 34E (Y) de T. cruzi II. Se evalu? la metaciclog?nesis del par?sito bajo condiciones de ayuno prolongado para T. cruzi II y realimentaci?n con sangre de ave y mam?fero en ambas cepas. La producci?n de flagelados de T. cruzi II en la ampolla rectal de R. prolixus, fue evidente a lo largo de las diez semanas evaluadas; los esferomastigotes y epimastigotes estuvieron constantes a lo largo del tiempo, mientras que los tripomastigotes ascendieron bruscamente en las ?ltimas semanas de infecci?n, generando diferencias estad?sticamente significativas entre los periodos evaluados. En la comparaci?n de la infecci?n de T. cruzi II (resultados de este trabajo) con T. cruzi I (datos obtenidos por Granada, 2012) en insectos de la especie R. prolixus (domiciliado) mantenidos en ayuno, se pudo observar que los esferomastigotes y epimastigotes, fueron abundantes en el genotipo I presentando diferencias significativas con el genotipo II, pero las poblaciones de tripomastigotes metac?clicos fueron similares. En el l?men y la pared rectal de los insectos realimentados despu?s de un periodo de inanici?n de 60 d?as, los epimastigotes y tripomastigotes de T. cruzi I estuvieron siempre en mayor proporci?n que los de T. cruzi II. As? mismo, fue evidente como la metaciclog?nesis en insectos realimentados con sangre aviar fue menor que en los insectos realimentados con sangre de mam?fero, existiendo diferencias estad?sticamente significativas. Los resultados revelan que en insectos mantenidos en ayuno, la metaciclog?nesis de T. cruzi I y II tiende a la estabilidad, mientras que la realimentaci?n en los mismos, estimula el incremento de los tripomastigotes metac?clicos. Estos resultados tambi?n confirman que T. cruzi I se desarrolla en mayor proporci?n que T. cruzi II en la ampolla rectal de R. prolixus.ABSTRACT Among vectors of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, the Rhodnius gender is of great importance, because its species are distributed in all geographical regions of Colombia and particularly R. prolixus is able to colonize human dwellings in endemic areas. Chagas disease is mainly caused by T. cruzi I genotype in domestic and wild transmission cycles in Colombia. This genotype can be found in around of 80% of the isolates in insect vectors. The T. cruzi II lineage has been detected in mammals, wild vectors and can be found infecting Chagasic patients in our country. The transmission cycle mechanisms that facilitate the dispersal of this genotype are unknown. In accordance with this fact, it is necessary to study the vectorial capacity of domestic and wild species of triatomines from Colombia to transmit this genotype. In this paper, we studied the metacyclogenesis in vivo of T. cruzi I and T. cruzi II in domestic R. prolixus. One hundred and ninety eigth infected nymphs from third to fifth instar of R. prolixus, maintained in the laboratory were fed on mice infected with T.cruzi I MHOM/C0/04/MG strain or T. cruzi II 34E (Y) strain. The metacyclogenesis of T. cruzi II in R. prolixus submitted to prolonged fasting conditions were evaluated. By the other hand, the metacyclogenesis of o T. cruzi I and T. cruzi II were evaluated in R. prolixus submitted to take blood meal on hens and mice after a starvation period of 60 days. Flagellate production of T. cruzi II in the rectal ampulla R. prolixus, was evident during ten weeks after the first blood meal. The esferomastigotes and epimastigotes were constant over time, whereas the production of trypomastigotes were higher in the last few weeks of infection with statistically significant differences between the periods evaluated. When we compared the infection of T. cruzi II (results of this work) with infection of T. cruzi I (data from Granada, 2012) in fasted domestic R. prolixus, it was observed that the esferomastigotes and epimastigotes, were more abundant in T. cruzi I with significant differences with T. cruzi II, but the number of metacyclic trypomastigotes were similar. Into the lumen and the rectal wall of insect submitted to take of blood meal after a starvation period of 60 days, the tripomastigotes and epimastigotes of T. cruzi I, were always seen at higher rates than those of T. cruzi II. The metacyclogenesis in R. prolixus submitted to take avian blood meal after a starvation period of 60 days were lower than in the insects fed in the same conditions with mammalian blood, the results showed statistically significant differences. This work revealed that in fasted R. prolixus, the metacyclogenesis of T. cruzi I and T. cruzi II tend to stability, while in insects submitted to take of blood meal after a starvation period of 60 days, we observed stimulation for the growth of metacyclic trypomastigotes. These results also confirm that T. cruzi I grows in greater proportion than T. cruzi II in the rectal ampulla from R. prolixus.CONTENIDO INTRODUCCI?N 20 1. JUSTIFICACI?N 28 2. OBJETIVOS 31 2.1 OBJETIVO GENERAL 31 2.2 OBJETIVOS ESPEC?FICOS 31 3. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA 32 4. MARCO DE REFERENCIA 38 4.1 ENFERMEDAD DE CHAGAS 38 4.1.1 Ciclos de transmisi?n. 42 4.1.2 V?as de infecci?n: 43 4.1.3 Manifestaciones cl?nicas de la enfermedad de Chagas. 45 4.1.4 Tratamiento etiol?gico. 47 4.2 El PAR?SITO Trypanosoma cruzi. 49 4.2.1 Aspectos generales de T. cruzi. 49 4.2.2 Clasificaci?n taxon?mica. 52 4.2.3 Ciclo Biol?gico. 53 4.2.4 Variabilidad gen?tica de T. cruzi. 55 4.2.4 Distribuci?n de las DTUs. 57 4.3 VECTORES DE T. cruzi. 59 4.3.1 Generalidades de los triatominos. 59 4.3.2 Clasificaci?n taxon?mica y especies de triatominos. 60 4.3.3 Biolog?a de los vectores de T. cruzi. 61 4.3.4 Sistema digestivo de los triatominos. 63 4.3.4 Distribuci?n de las principales especies vectoras de T. cruzi. 65 4.3.5 Vectores de T. cruzi en Colombia. 67 4.3.6 Rhodnius prolixus. 69 4.4 INTERACCI?N PAR?SITO-VECTOR 71 4.4.1 Aspectos generales de la interacci?n par?sito-vector. 71 4.4.2 Mecanismos inmunol?gicos del vector. 72 4.4.3 Componentes intestinales del vector. 74 4.4.4 Capacidad de adhesi?n del flagelado. 76 4.4.5 Metaciclog?nesis. 77 4.4.6 Capacidad y competencia vectorial. 82 4.4.7 Metaciclog?nesis y transmisi?n oral de la enfermedad de Chagas. 83 5. MATERIALES Y M?TODOS 85 5.1 MATERIAL BIOL?GICO 85 5.1.1 Cepas de T. cruzi y mantenimiento in vivo. 85 5.1.2 Establecimiento de curvas de parasitemia. 85 5.1.3 Mantenimiento in vitro de cepas T. cruzi. 85 5.1.4 Insectos triatominos de la especie Rhodnius prolixus. 86 5.1.3 Mantenimiento de los animales de experimentaci?n. 86 5.2 CARACTERIZACI?N MOLECULAR DE CEPAS DE T. cruzi. 87 5.2.1 Digesti?n de par?sitos y extracci?n de ADN. 87 5.2.2 Reacci?n en cadena de la polimerasa (PCR). 87 5.2.3 Visualizaci?n de los productos de amplificaci?n. 90 5.3 EVALUACI?N DE LA METACICLOG?NESIS 90 5.3.1 Metaciclog?nesis de Trypanosoma cruzi II en Rhodnius prolixus (domiciliado) bajo condiciones de ayuno prolongado. 90 5.3.2 Efecto de la fuente y la realimentaci?n de R. prolixus sobre la metaciclog?nesis de T. cruzi I y T. cruzi II. 90 5.3.4 Infecci?n en los triatominos. 91 5.3.5 Disecci?n de triatominos. 92 5.3.6 Extendido y coloraci?n de las muestras. 92 5.3.7 Preparaci?n de soluciones de coloraci?n. 92 5.4 AN?LISIS ESTAD?STICO 93 6. RESULTADOS 94 6.1 CARACTERIZACI?N MOLECULAR DE CEPAS DE T. cruzi. 94 6.1.1 PCR espec?fica con los iniciadores TC/TC1/TC2. 94 6.2 EVALUACI?N DE LA METACICLOG?NESIS BAJO CONDICIONES DE AYUNO PROLONGADO 95 6.2.1 Parasitemias de los ratones e infecci?n de los triatominos. 95 6.2.2. An?lisis de regresi?n lineal entre las formas sangu?neas ingeridas y n?mero de par?sitos de T. cruzi II encontrados en la ampolla rectal de R. prolixus (domiciliado). 95 6.2.3 An?lisis del desarrollo de T. cruzi II en R. prolixus domiciliado mediante la prueba de planitud. 99 6.2.4 An?lisis del comportamiento de los diferentes estadios morfol?gicos de T. cruzi mediante las pruebas de paralelismo y coincidencia. 104 6.2.5 Comparaci?n de las cantidades porcentuales y del comportamiento de cada uno de los estadios morfol?gicos de T. cruzi. 107 6.2.6 Comparaci?n de la infecci?n de T. cruzi I y II en la ampolla rectal de R. prolixus (domiciliado). 108 6.3 EFECTO DE LA FUENTE Y LA REALIMENTACI?N DE R. prolixus SOBRE LA METACICLOG?NESIS DE T. cruzi I Y T. cruzi II. 115 6.3.1 Parasitemias de los ratones e infecci?n de los triatominos. 115 6.3.2 Regresi?n lineal de la comparaci?n entre las metodolog?as de conteo (C?mara de Neubauer ? OMD de placas coloreadas). 115 6.3.3 Comparaci?n entre fuentes de alimento. 119 6.3.4 Comparaci?n entre genotipos del par?sito. 122 6.3.5 Comparaci?n entre estructuras rectales. 125 6.3.6 Comparaci?n entre los genotipos de T. cruzi, dependiendo de la fuente de alimento. 127 6.3.7 Comparaci?n entre las poblaciones de T. cruzi en las diferentes porciones del recto evaluadas. 130 6.3.8 Comparaci?n entre estadios morfol?gicos de T. cruzi. 134 6.3.9 Comportamiento del total de epimastigotes y tripomastigotes metac?clicos en el l?men y la pared rectal a lo largo del tiempo. 136 6.3.10 Comportamiento del total de tripomastigotes metac?clicos a lo largo del tiempo. 142 7. DISCUSI?N 144 7.1 EVALUACI?N DE LA METACICLOG?NESIS BAJO CONDICIONES DE AYUNO PROLONGADO. 144 7.2 EFECTO DE LA FUENTE DE ALIMENTO Y LA REALIMENTACI?N DE R. prolixus SOBRE LA METACICLOG?NESIS DE T. cruzi I Y T. cruzi II. 149 8. CONCLUSIONES 158 9. RECOMENDACIONES 159 REFERENCIAS 127 ANEXOS 146