La mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS), o síndrome de Sanfilippo tipo B es una enfermedad neurodegenerativa causada por la deficiencia de la enzima α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU; E.C. 3.2.1.50) que conlleva a la acumulación del glicosaminoglicano heparán sulfato en los lisosomas celulares causando alteraciones a nivel del sistema nervioso central y anomalías en diferentes órganos y tejidos. Se han propuesto diferentes tratamientos entre los que se encuentra la terapia de remplazo enzimático (TRE), la cual permite la reducción del sustrato acumulado por medio del suministro de proteínas recombinantes activas. Usualmente las proteínas utilizadas para las TRE han sido producidas en células de mamífero, sin embargo, en los últimos años se han evaluado nuevos sistemas de expresión, entre los que destacan las levaduras como Komagataella phaffii (también conocida como Pichia pastoris), la cual presenta ventajas en cuanto a su producción y manejo. La expresión de proteínas recombinantes para aplicaciones biotecnológicas y terapéuticas requiere el uso de sistemas con altos rendimientos de expresión, con esto en cuenta, un microorganismo como Komagataella phaffii necesita de condiciones de cultivo específicas para su crecimiento y posterior producción de las proteínas de interés. En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) se han desarrollado investigaciones evaluando el efecto de algunas variables de cultivo como la temperatura, la adición de sustratos y cosustratos en diferentes concentraciones, la disponibilidad de O2 entre otras, con el fin de mejorar la producción de las proteínas recombinantes a escala de biorreactor (1,65L). Adicionalmente, se han evaluado condiciones de cultivo, como la adición de sorbitol y uso de chaperonas farmacológicas, a la misma escala de producción, para la cepa K. phaffii ΔOCH1, para la producción de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS), con el fin de obtener una enzima con N-glicosilaciones humanizadas. Sin embargo, dadas las características morfológicas particulares de esta cepa, se vio la necesidad de realizar en el IEIM una revisión de literatura sobre las posibles estrategias de cultivo que permitan el mejoramiento de la producción de proteínas recombinantes en cepas modificadas genéticamente. Datos colectados en esta revisión mostraron que el uso de co-sustratos durante el proceso de producción pueden contribuir al mejoramiento en la obtención de proteínas recombinantes tanto en cepas modificadas como no modificadas genéticamente. Actualmente, en el IEIM se ha estado trabajando en la producción de la enzima lisosomal alfa-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU) tanto en la cepa K. phaffii GS115 como en la cepa ΔOCH1 en medio BMMY a escala de 100 y 400mL en agitación, con los cuales se ha logrado obtener actividades en promedio 0,12 y 0,19 U/mL respectivamente. En el presente estudio, y teniendo en cuenta las sugerencias de Triviño, 2020 sobre el uso de co-sustratos en el proceso productivo, se planteó experimentalmente un diseño factorial de dos niveles (23), con el fin de evaluar el efecto de la adición de metanol, sorbitol y sulfato de amonio como co-sustratos en el medio de cultivo FM22 para la producción de la enzima NAGLU recombinante en la levadura Komagataella phaffii GS115. Esta evaluación se realizó inicialmente a escala de 100mL, con el fin de escoger la condición que mostrara un mejoramiento en la actividad enzimática comparada con la obtenida en el medio de cultivo FM22 estándar utilizado en trabajos previos a escala de biorreactor en el IEIM, en el cual únicamente se adicionaba metanol 0,5%. Adicional a la medición de actividad enzimática en el extracto crudo, se cuantificó la biomasa (g/L) y las proteínas totales producidas (mg/mL). Del resultado de los experimentos del diseño factorial a 100mL, se seleccionó la mejor combinación de las concentraciones de los 3 factores (metanol, sorbitol y sulfato de amonio), y se escaló a 400mL. Todos los experimentos desarrollados en este trabajo se llevaron a cabo por duplicado. Los resultados obtenidos representan la primera evidencia de un aumento de actividad enzimática de NAGLU a partir de la adición de co-sustratos al medio de cultivo FM22 a escala de laboratorio, esto como un primer paso para una posible optimización del proceso de producción a escala de reactor para la obtención de mayores cantidades de proteína recombinante activa que permitan continuar con los esfuerzos en el desarrollo de una TRE para pacientes con MPS IIIB.