| dc.description | Las hormonas esteroidales llevan a cabo la mayoría de sus acciones, y subsecuentes
actividades biológicas, modulando la transcripción de células blanco a través de su
interacción con receptores ubicados en el citoplasma o núcleo. Este mecanismo de acción
se conoce como "clásico" o "genómico". Sin embargo, en los últimos añ.os, se ha
acumulado importante evidencia que sugiere que muchos esteroides inducirían cascadas de
señalización independiente de la transcripción, el cual se ha denominado "mecanismo de
acción no genómico o no clásico".
Un proceso fisiológicamente importante que claramente depende de mecamsmos no
genómicos, es la maduración de ovocitos de anfibios inducida por progesterona. Esta
hormona esteroidal promueve en los ovocitos la reiniciación del ciclo celular, que se
caracteriza por la ruptura de su vesícula germinal (GVBD), sistema que representan un
excelente modelo de estudio por su gran tamañ.o, su fácil manipulación y visualización del
proceso de maduración a través de la aparición del GVBD. Trabajos previos sugieren que el
mecanismo de acción de progesterona en los ovocitos sería diferente al modo de acción
clásico y se ha propuesto que el esteroide interaccionaría con un receptor de membrana
plasmática, lo que conduciría a la inhibición del sistema efector adenilil ciclasa, a la
disminución en los niveles intracelulares de AMP cíclico y a la posterior maduración del
ovocito. Actualmente existe una gran controversia con respecto a la identidad del receptor
de progesterona que estaría participando en el proceso de maduración meiótica en el
ovocito. Al respecto, se ha postulado que sería el mismo receptor clásico citosólico (xPR-1)
el que estaría mediando la acción del esteroide a nivel de la membrana plasmática. Sin
embargo, el principal problema que presenta esta hipótesis, es poder demostrar la
localización de xPR-1 a nivel de la membrana plasmática del ovocito.
Por lo tanto, el objetivo central de esta tesis, fue estudiar la localización subcelular
del receptor clásico de progesterona, xPR-1, e identificar el mecanismo involucrado en su
asociación a la membrana. Con este propósito, el receptor se expresó en ovocitos de
Xenopus laevis y se estudió: a) su efecto en la maduración inducida por progesterona y b)
su distribución subcelular. Además, xPR-1 se expresó en células Cos-7 en fusión a un epitope myc, para determinar mediante análisis de inmunocitoquímica su localización
intracelular.
Para determinar el o los mecanismos involucrados en la asociación del receptor a la
membrana se analizó si xPR-1 era palmitoilado, a través de la incorporación de ácido
palmítico tritiado, o si éste interaccionaba con proteínas de tipo "scaffold", como caveolina.
Además, se trató de identificar a través de ensayos de coinmunoprecipitación y de
purificación por cromatografia de afinidad en tandem (TAP-TAG), proteínas que
interaccionaran con xPR-1.
Los principales resultados obtenidos en esta tesis fueron los siguientes: 1) Se detectó en
extracto de ovocitos una muy baja expresión de xPR-1 endógeno y solamente en la fracción
citosólica. 2) Al sobreexpresar xPR-1 en ovocitos se encontró, además de una gran cantidad
de proteína citosólica, una pequeña fracción de receptor asociada a la membrana
plasmática, observándose también un aumento en el número de ovocitos que maduraron en
relación con los ovocitos control. 3) La adición de una señal de miristoilación y
palmitoilación en el extremo amino terminal de xPR-1 (mp-xPR-1), aumentó como era de
esperar la cantidad de receptor asociado a la membrana y además incrementó
significativamente la sensibilidad de los ovocitos a progesterona, validando su función a
nivel de la membrana plasmática. 4) Al sobreexpresar xPR-1 en células Cos-7, se observó
una fracción del receptor asociado a la membrana plasmática de las células, las cuales
además adquirieron la capacidad de unir el ligando progesterona-BSA-FITC, que es
impermeable a las células. 5) La mitad C-terminal de xPR-1, que incluye el DBD y el LBD,
y el dominio LBD de xPR -1 se asociaron a la membrana plasmática, mientras que la región
N-terminal de éste, se localizó sólo en el citosol de la célula. 6) No se observó
incorporación de ácido palmítico en xPR-1 y la mutación del residuo de cisteína 619 no
generó cambios en su asociación a la membrana ni en la cinética de maduración. 7) Se
observó interacción de xPR-1 con caveolina-1, tanto en ausencia como en presencia de
progesterona. 8) Gf3 fue coinmunoprecipitada y copurificadajunto a xPR-1, lo cual sugiere
que el receptor estaría interaccionando con el dímero G¡3y en la ausencia de progesterona. | |
