| dc.description | La línea celular multipotencial P19 se induce a diferenciarse al linaje neuronal o
muscular con la formación de agregados celulares, llamados neuroesferas (NF) y la
presencia de ácido retinoico (AR) o dimetilsulfóxido (D'v1SO), respectivamente. Luego
de la inducción de la diferenciación, las NF sembradas en placas adherentes y expresan
marcadores de neuronas maduras o de compromiso miogénico. Las células P19
indiferenciadas expresan la conexina 43 (Cx43) y canales de uniones en hendidura
(CtJH) funcionales. Las conexinas son proteínas que forman CUH y hemicanales (HCsCx),
los que comunican el citoplasma de una célula con el de las células en contacto o
con el espacio extracelular, respectivamente. Durante la diferenciación neuronal, la
Cx43 disminuye progresivamente hasta desaparecer en las neuronas. Los CUH son
permeables a iones y pequeñas moléculas como ATP, y segundos mensajeros como Ca 2
e IP3, y durante la ontogenia se encuentran ampliamente distribuidas en las células del
sistema nervioso. Sus funciones se desconocen, pero se les postula un papel en la
adquisición del compromiso neuronal, diferenciación regional, crecimiento y guía de
axones y formación de sinapsis. Por su parte, los HCs también pueden estar formados
por panexinal (Pxl), que pertenece a una familia de proteínas sin homología con las Cxs
en su secuencias amino acídica. La Pxl y la Cx43 son abundantemente expresada por los
precursores de las células del sistema nervioso, pero sus posibles funciones como HCs
aún se desconocen.
El objetivo general de esta tesis fue evaluar el papel de la Cx43 en la
neurogénesis. Primero se evaluó si CNTF, una neurocitoquina que afecta la
diferenciación neuronal y que aumenta la expresión de la Cx43 en astrocitos, promueve
la diferenciación neuronal en las células P19. El CNTF aumentó los niveles de la Cx43, la la comunicación intercelualr mediada por CUH y la adquisición de compromiso
neuronal, pero no se detectó el marcador neuronal NeuN. Luego se estudió si la
expresión sostenida de la Cx43 altera la diferenciación neuronal en las células P19. Para
esto, se realizó una transfección estable del ADNc de_la Cx43 en las células P19 (P19-
Cx43). Después de 48 h del tratamiento con AR. las células P19 y P19-Cx43 expresaron
el marcador de compromiso neuronal nestina, pero en el día 4 solo las células P19
adquirieron la morfología neuronal y el marcador NeuN. La expresión de la Cx43 y el
acoplamiento celular al colorante amarillo de Lucifer disminuyeron significativamente
en las células P19, no así en las P19-Cx43 tratadas con AR.
Luego, se estudió si la función de canal de la Cx43 (sin el carboxilo terminal que
interactúa con las vías de senalización intracelular y proteínas de andamio) es suficiente
para impedir el proceso de diferenciación neuronal. Las células P19 fueron transfectadas
con la Cx43 truncada en el aminoácido 257 del extremo C-terminal. (P19-Cx43CT). Las
células P19 tratadas con AR expresaron los marcadores tempranos nestina y tubulina -
III, y las células P19-Cx43CT expresaron nestina, pero no tubulina 0111. Más tarde, no se
detectó células P19-Cx43CT con morfología neuronal o con inmunoreactividad de
NeuN.
Se ha sugerido que ATP actúa como señal de proliferación en los progenitores
neurales y que podría ser regulador negativo de la diferenciación. Concordantemente.
suramina (bloqueador de los receptores purinérgicos) o La 3(bloqueador de los
receptores purinérgicos de la familia P2X y de los HC-Cx) agregados simultaneamente
con AR aumentaron significativamente los niveles de NeuN. Además, mediante HPLC.
sedemostró que las NF de células P19 liberan purinas al medio extracelular en
condiciones de agregación por 4 días, y los niveles fueron menores en el medio de las
células tratadas con AR y en las P19-Cx43CT tratadas o no con AR. Concordantemente, las NF de las células P19 presentaron actividad de HCs, la que fue bloqueada con La 3 , y
fue significativamente menor en las NF tratadas con AR y en las P19-Cx43CT tratadas o
no con AR. Consecuentemente, se sugiere que la Cx43-257 actuaría como dominante
negativo de la Cx43 endógena, ya que esta última se detectó en la membrana mediante
biotinilación de proteínas de superficie celular.
Ya que las células P19-Cx43 tratadas con AR no se diferenciaron a neuronas, se
estudió la posibilidad de que se comprometan al linaje de músculo esquelético,
detectándose MyoD en el día 9 luego de la agregación. La diferenciación miogénica
requiere de Ai'P extracelular y los HCs formados por la Cx43 (HCs-Cx43) son una vía
de liberación de esta molécula al medio extracelular, la cual podría aumentar en las
células tranfectadas con la Cx43. Así, el AR evitaría la diferenciación a neuronas, y en
su ausencia se fovorecería la diferenciación miogénica. Para evaluar si ATP induce la
adquisición de compromiso miogénico, las células P19 fueron tratadas durante 4 días
con DMSO o ATP en condiciones de agregación celular, y los niveles de MyoD fueron
evaluados después de 9 días. El tratamiento con ATP aumentó los niveles de MyoD
significativamente y de manera similar que el aumento inducido con DMSO.
Para estudiar si el ATP induce el compromiso miogénico, se usó células de
reserva (RC) aisladas de células C2C12, una línea celular mioblástica de ratón. Las RC,
no expresan marcadores de compromiso, y sembrarlas bajo condiciones de
diferenciación se diferencian a músculo esquelético. El tratamiento con distintas
concentraciones de ATP aumentó de manera concentración dependiente los niveles de
MyoD, y oATP. un bloqueador de los receptores P2X 1 P2X, y P2X7 , redujo el aumento
espontaneo de los niveles de MyoD. Además, mediante la captación de etidio inducida
con ATP, se determinó que las RC poseen receptores P2X funcionales. La captación de
etidio inducida con ATP fue bloqueada con oATP u oleamida (bloqueadores de HCs). Ya que no se detectó actividad de HCs-Cxs es posible que los receptores P2X estén
acoplados a HCs-Pxl y no a HCs-Cxs. Por ende, los l-IC-Pxl actuarían como vías de
liberación de ATP. De acuerdo a esta interpretacion, ácido l83- glicirretínico y
oleamida, bloqueadores de los CUH y HCs, previnieron el aumento en los niveles de
MyoD, en un tiempo en que las RC presentan HCs-Pxl y no CUH o HCs-Cxs
funcionales.
Finalmente, se propone que la Cx43 inhibe la diferenciación neuronal,
posiblemente constituyendo una vía de liberación de ATP, que en células P19 promueve
la adquisición de compromiso a musculatura esquelética. A su vez, el ATP, liberado a
través de HCs-Pxl, promueve la adquisición del compromiso miogénico en las células
C2C12 de reserva, mediante la activación de los receptores P2X. | |
