| dc.contributor | Martínez Moya, Ronny Ernesto | |
| dc.contributor | UNIVERSIDAD DE LA SERENA | |
| dc.creator | Vargas Sepúlveda , Marta Aída | |
| dc.date | 2022-12-27T17:08:33Z | |
| dc.date | 2022-12-27T17:08:33Z | |
| dc.date | 2022-04-04 | |
| dc.date.accessioned | 2023-08-21T21:00:24Z | |
| dc.date.available | 2023-08-21T21:00:24Z | |
| dc.identifier | 21181194 | |
| dc.identifier | https://hdl.handle.net/10533/40073 | |
| dc.identifier.uri | https://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8281694 | |
| dc.description | 5-hydroxytryptophan (5-HTP) is the direct precursor of serotonin which is an important
neurotransmitter in humans that regulates a series of neurological, physical, and
psychological functions. Currently 5-HTP is obtained from the seeds of Griffonia
simplicifolia. However, its production is restricted to Nigeria, Benin, Togo, and Ghana,
with a stationary production and sustainability problems (the plant has been classified
"endangered"), which suggests a shortage of 5-HTP. Due to this, interest has been
generated in investigating new strategies for obtaining 5-HTP. The reduced or absent
presence of 5-HTP in other vegetables and the projections of developing an industrial
process using microorganisms with heterologous genes still face great challenges such as
the use of the substrate tryptophan (Trp) or high-cost cofactors such as
tetrahydrobiopterin, low stability and activity of heterologous hydroxylases, and low
overall yields in the production of 5-HTP. Therefore, the hypothesis “5-HTP can be
synthesized in an in vitro reaction from a pure and / or complex source of tryptophan
(hydrolysate of pumpkin seeds) using a heterologous hydroxylase” was proposed. The
main objective was to develop and validate a proposal for in vitro conversion of
tryptophan to 5-hydroxytryptophan, using a heterologous aromatic amino acid
hydroxylase, for its application in obtaining a product enriched in 5-hydroxytryptophan
generated from pumpkin seed proteins (Cucurbita maxima). In a first stage, a chemical
characterization of the raw material was carried out and a methodology was established
to obtain protein isolates from pumpkin seed flour (Cucurbita maxima). Based on
preliminary studies in which the pH of solubilization was varied (pH 8.0, 9.0 and 10.0)
and pH of precipitation (pH 4.0, 5.0 and 6.0) a protein extraction protocol was established
by an alkaline solubilization with NaOH (pH 8.0) and isoelectric precipitation (acid
precipitation with HCl, pH 5.0). Then the protein extract was characterized in terms of
amino acid composition and the effect of five protease preparations (Alcalase,
Flavourzyme, Papain, Protease from B. amyloliquefaciens and Chymotrypsin) was studied
for hydrolysis, where the effect on the release of tryptophan was evaluated, the potential
antioxidant activity in vitro and the degree of hydrolysis, for the purpose of selecting
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hydrolysates that can be potential sources of free Trp for its subsequent in vitro conversion
to 5-HTP, through a heterologous hydroxylase. In this study to detect and quantify 5-HTP,
an alternative methodology to the one traditionally used HPLC quantification was
developed, based on the fluorescence emitted by the compound at 310 nm in a microplate
reader. Regarding the production of a heterologous hydroxylase, a fragment of a TPH1
was cloned and expressed in E. coli. The cell enzyme compartmentalization was studied
to define strategies focused on increasing both enzyme activity as production yield. To
increase the enzyme activity, the enzymatic reaction was modified varying the amount of
the tetrahydrobiopterin cofactor and the rate of injection of molecular oxygen and, the
effect of surfactants on the activity was also evaluated. In addition, the production process
of the TPH1 was studied in a flask and in a 2 L agitated tank bioreactor. The effect of
aeration (0.25, 0.50 and 0.75 vvm) and agitation (150, 250 and 500 rpm) on the production
of biomass, pH, volumetric coefficient of oxygen transfer (kLa) and activity of the TPH1
were evaluated in a bioreactor scale.
The results showed that protein extracts obtained with a solubilization at pH 8.0 and
precipitation at pH 5.0 presented 82.7% of proteins. The different hydrolysates obtained
with the five preparations generated different characteristics in terms of Trp free content,
degree of hydrolysis and antioxidant activity. Hydrolysates obtained with Flavourzyme
and Chymotrypsin generated free Trp (337.9 ± 15.2 and 131.6 ± 22mg / 100 g of protein
extracts, respectively) and antioxidant capacity (371.1 ± 22.6 and 114.1 ± 5.3 mmol TE /
100 g m.s., respectively). Cloning and expression of the TPH1 was possible in the E. coli
C41(DE3) strain at flask scale and agitated tank bioreactor. Under different operating
conditions in a tank with mechanical agitation, with a low aeration of 0.25 vvm and with
an intermediate or high agitation (250 rpm and 500 rpm, respectively) the highest activity
of the TPH1 enzyme was quantified.
The highest production of E. coli C41(DE3) cell biomass was 3.46 g/L detected at
intermediate values of aeration and agitation (0.50 vvm and 250 rpm). The highest kLa
values were obtained under higher agitation conditions (500 rpm) for the three aeration
levels used (0.25, 0.5 and 0.75 vvm), with kLa values of 0.011, 0.013 and 0.016 s-1
,
22
respectively. However, there was no direct correlation with the enzymatic activity of
TPH1.
The developed method for the identification and quantification of 5-HTP, based on the
detection of fluorescence in a plate reader allowed to establish a new methodology for the
quantification of 5-HTP product of a hydroxylation reaction. Finally, the addition of the
surfactant Tween 20 in concentrations of 0.1 and 1 % in the culture medium did not inhibit
the activity of the TPH1 enzyme and expanded the pH range of its activity in comparison
to the TPH1 enzyme without the addition of surfactant.
In conclusion, this study contributes by providing new knowledge for optimizing and
scaling processes for the extraction of protein from pumpkin seed, its hydrolysis, and
bioconversion through the production of a heterologous hydroxylase TPH1, to obtain a
protein hydrolysate enriched in 5-HTP. | |
| dc.description | 5-hidroxitriptófano (5-HTP) es el precursor directo de la serotonina, un importante
neurotransmisor en mamíferos que regula una serie de funciones neurológicas, físicas y
psicológicas. Actualmente 5-HTP se obtiene de las semillas de Griffonia simplicifolia, no
obstante, su producción está restringida en las costas de países como Nigeria, Benin, Togo
y Ghana, con una producción estacionaria y con problemas de sustentabilidad (la planta
se ha clasificado “en peligro de extinción”), lo que hace prever la escasez de 5-HTP. Esto
ha generado un interés en investigar nuevas estrategias para la obtención de 5-HTP. La
baja o nula presencia de 5-HTP en otros vegetales y las proyecciones de desarrollar un
proceso industrial mediante el uso de microorganismos con genes heterólogos enfrentan
aún grandes desafíos como el uso del sustrato triptófano (Trp) o cofactores como la
tetrahidrobiopterina de altos costos, baja estabilidad y actividad de las hidroxilasas
heterólogas y bajos rendimientos en la producción de 5-HTP.
Por lo tanto, la hipótesis planteada fue que 5-HTP puede ser sintetizado en una reacción
in vitro a partir de una fuente pura y/o compleja de triptófano (hidrolizado de semillas de
zapallo) usando una hidroxilasa heteróloga. El objetivo general fue desarrollar y validar
una propuesta de conversión in vitro de triptófano en 5-hidroxitriptófano, utilizando una
hidroxilasa heteróloga de aminoácido aromático, para su aplicación en la obtención de un
producto enriquecido en 5-hidroxitriptófano generado a partir de proteínas de semillas de
zapallo (Cucurbita maxima). En una primera etapa se realizó una caracterización química
de la materia prima y se estableció una metodología para la obtención de extractos de
proteína de la harina de semillas de zapallo (Cucurbita maxima). En base a estudios
preliminares en que se varió el pH de solubilización (pH 8.0, 9.0 y 10.0) y el pH de
precipitación (pH 4.0, 5.0 y 6.0) se estableció un protocolo de extracción de proteínas
mediante una solubilización alcalina con NaOH (pH 8.0) y precipitación isoeléctrica
(precipitación ácida con HCl, pH 5.0). Luego se caracterizó el aislado proteico en cuanto
a su composición de aminoácidos y se estudió el efecto de cinco preparaciones de
proteasas (Alcalasa, Flavourzyme, Papaína, Proteasa de B. amyloliquefaciens y
Quimotripsina) en la hidrólisis, donde se evaluó el efecto sobre la liberación de triptófano,
la potencial actividad antioxidante in vitro y el grado de hidrólisis, con la finalidad de
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seleccionar él o los hidrolizados que puedan ser potenciales fuentes de Trp libre para su
posterior conversión in vitro en 5-HTP, a través de una hidroxilasa heteróloga. Para
detectar y cuantificar 5-HTP, en este estudio se desarrolló una metodología alternativa a
la tradicionalmente usada (HPLC), basada en la fluorescencia que emite el compuesto a
310 nm en un lector de microplacas. En relación con la producción de una hidroxilasa
heteróloga, en este estudio se clonó y expresó un fragmento de una Triptófano Hidroxilasa
Humana (TPH1) en E. coli. Se estudió la compartimentalización de la enzima en la célula
para definir estrategias focalizadas en aumentar tanto la actividad de la enzima y como el
rendimiento de producción de 5-HTP. Para aumentar la actividad de la enzima se modificó
la reacción enzimática variando la cantidad del cofactor tetrahidrobiopterina y la tasa de
inyección de oxígeno molecular y además se evaluó el efecto de surfactantes sobre la
actividad. Por otra parte, se estudió el proceso de la producción recombinante del
fragmento TPH1 en matraz y en un biorreactor de tanque agitado de 2 L. En un biorreactor
se evaluó el efecto de la aireación (0.25, 0.50 y 0.75 vvm) y agitación (150, 250 y 500
rpm) sobre la producción de biomasa, pH, coeficiente volumétrico de transferencia de
oxígeno (kLa) y actividad enzimática del fragmento TPH1.
Los resultados mostraron que extractos proteicos obtenidos con una solubilización a pH
8.0 y precipitación a pH 5.0 presentaron un 82.7% de proteínas. Los diferentes
hidrolizados obtenidos con las cinco preparaciones generaron distintas características en
cuanto al Trp libre contenido, grado de hidrólisis y actividad antioxidante. Hidrolizados
obtenidos con Flavourzyme y Quimotripsina generaron Trp libre (337.9 ± 15.2 y 131.6 ±
22 mg / 100 g de extractos proteicos, respectivamente) y capacidad antioxidante (371.1 ±
22.6 y 114.1 ± 5.3 mmol TE/100 g m.s., respectivamente).
La clonación y expresión del fragmento TPH1 fue posible en la cepa E.coli C41(DE3) a
escala de matraz y biorreactor de tanque agitado. Bajo diferentes condiciones de operación
en un tanque con agitación mecánica, con una aireación baja de 0.25 vvm y con una
agitación intermedia o alta (250 rpm y 500 rpm, respectivamente) se cuantificó la mayor
actividad de la enzima TPH1. La mayor producción de biomasa celular de E. coli
C41(DE3) fue de 3.46 g/L detectado en valores intermedios de aireación y agitación (0.50
vvm y 250 rpm). Los mayores valores de kLa fueron obtenidos bajo condiciones de mayor
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agitación (500 rpm) para los tres niveles de aireación utilizados (0.25, 0,5 y 0.75 vvm),
con valores de kLa de 0.011, 0.013 y 0.016 s-1
, respectivamente. No obstante, no hubo una
correlación directa con la actividad enzimática de TPH1.
El método desarrollado para la identificación y cuantificación de 5-HTP, basado en la
detección de fluorescencia en un lector de placa, permitió establecer una nueva
metodología para la cuantificación de 5-HTP producto de una reacción de hidroxilación.
Finalmente, la adición del surfactante Tween 20 en concentraciones de 0.1 y 1 % en el
medio de cultivo no inhibió la actividad de la enzima TPH1 y amplió el rango de pH de
su actividad en comparación a la enzima TPH1 sin adición de surfactante.
En conclusión, este estudio contribuye a otorgar nuevos conocimientos para un proceso
de optimización y escalado en la extracción de proteínas de semillas de zapallo, hidrólisis,
producción de una hidroxilasa heteróloga TPH1e hidroxilación de Trp, con la finalidad de
ser aplicado en la obtención de un hidrolizado proteico enriquecido en 5-HTP. | |
| dc.description | Expreso mi agradecimiento a todas las personas que contribuyeron al desarrollo y
enriquecimiento de este trabajo de tesis, especialmente a los profesores Dr. Ronny
Martínez, director de esta tesis, a la Dra. Claudia Bernal, al Dr. Francisco Deive y a la
Dra. María Álvarez, que constantemente brindaron su apoyo.
Agradezco el apoyo incondicional de mi familia y a aquellos que, de una u otra manera
colaboraron en diferentes etapas de este trabajo.
Finalmente, quiero agradecer el financiamiento otorgado por la Beca de Doctorado
Nacional de CONICYT (Folio N°21181194) y al proyecto FONDECYT 1190217. | |
| dc.format | application/pdf | |
| dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Spain | |
| dc.rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/ | |
| dc.subject | oecd::Ingeniería y Tecnología | |
| dc.title | STUDY OF PROTEINS OF PLANT ORIGIN AS A SOURCE OF TRYPTOPHAN FOR YOUR IN VITRO CONVERSION INTO 5-HYDROXYTRYPTOPHAN BY A HETEROLOGOUS HYDROXYLASE | |
| dc.type | Tesis | |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | |
