Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacteria forming spores, which produces parasporal crystals of a proteic nature, toxic against various orders of insects and biodegradable and harmless to other species. This research use the experimental model, allowing, through observation techniques, microbiological and biochemical identification of B. thuringiensis from soil samples from municipalities of Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano and Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia, and its subsequent characterization with molecular markers Bc-Rep and MB1. Microbiological and biochemical tests identified 10 isolates as B. thuringiensis; the results of phylogenetic analysis showed significant differences in the clusters obtained with Bc-Rep and MB1 markers. With Bc-Rep a low index of similarity (18%) was recorded, while with the marker MB1 a higher similarity index, 58%, was obtained. This work indicated a great genetic variability among isolates, showing that markers Bc-Rep and MB1 are highly effective to differentiate closely related strains, thus becoming a genetic tool of great value for studies of identification and diversity in B. thuringiensis.Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram-positiva formadora de esporas, que produce cristales parasporales de naturaleza proteica, tóxicos contra diferentes órdenes de insectos y biodegradables e inocuos para otras especies. Esta investigación empleó el modelo experimental, que mediante técnicas de observación permitió, la identificación microbiológica y bioquímica de B. thuringiensis a partir de muestras de suelo de los municipios de Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia, y su posterior caracterización con los marcadores moleculares Bc-Rep y MB1. Se identificaron microbiológica y bioquímicamente 10 aislados como B. thuringiensis; los resultados del análisis filogenético mostraron diferencias significativas en los agrupamientos obtenidos con los marcadores Bc-Rep y MB1. Con Bc-Rep se registró un índice de similaridad bajo (18%), mientras que con el marcador MB1 se obtuvo un índice mayor de similitud, 58%. En este trabajo se evidenció una gran variabilidad genética entre los aislados, que mostraron a los marcadores Bc-Rep y MB1 como altamente efectivos para diferenciar cepas estrechamente relacionadas, convirtiéndose en una herramienta genética de gran valor para estudios de identificación y diversidad en B. thuringiensis.