El guayule (Parthenium argentatum) es una especie perenne nativa del desierto chihuahuense de México, que se utiliza como materia prima para la producción de hule natural (HN), látex y productos bioenergéticos. Sin embargo, la falta de recursos de germoplasma bien caracterizados y con alta productividad (concentración de hule mayor al 17% en peso), aunado a la poca información de la diversidad genética de P. argentatum que permitan un avance en la obtención de variedades altamente productivas, se ha convertido en una limitante que impide el desarrollo de la industria del hule de guayule en México. Por lo tanto, en la presente investigación, se estudió la diversidad genética de 160 ejemplares silvestres de P. argentatum, pertenecientes a cuarenta poblaciones individuales, de 5 estados (Nuevo León, Coahuila, Zacatecas, Durango y San Luis Potosí) usando el marcador del espacio interno transcrito (ITS). Se amplifico la región ITS1-ITS2 obteniéndose secuencias de una longitud de 649 pb, con una composición nucleotídica de A: 24.1 %; G: 26.5 %; C 25.8 % y T: 23.5 %. Esta región ITS1-ITS2, presentó 152 sitios polifórmicos, 27 haplotipos únicos con una alta diversidad (Hd: 0.738 ± 0.013), una diversidad nucleotídica (Pi) de 0.0027 ± 0.0094 y una distancia genética de 0.0092. La variación genética encontrada dentro de cada población (81.19 %) fue mayor que la encontrada entre las poblaciones de cada estado (16.55 %) y la encontrada entre estados (2.26 %) según mostraron los resultados del análisis de varianza molecular (AMOVA). Este resultado nos indica que el flujo de genes de las poblaciones silvestres dentro del desierto chihuahuense es continuo ya que no hubo una correlación obvia entre la distancia genética y la distancia geográfica. Se encontraron poblaciones importantes a conservar de acuerdo con la información genética silvestre encontrada como lo son las poblaciones SL6 y SL9 en San Luis Potosí, Z5 en Zacatecas y NL2 en el estado de Nuevo León.